Summary
뼈 전이 모델은 균일하게 또는 100% 발생률로 전이가 발생하지 않습니다. 직접 골내 종양 세포 주사는 폐 색전술을 초래할 수 있습니다. 우리는 고형 종양 이식편을 뼈에 이식하여 원발성 뼈 종양 및 뼈 전이를 모델링하여 재현 가능한 생착 및 성장을 유도하는 기술을 제시합니다.
Abstract
원발성 뼈 종양 또는 고형 종양의 뼈 전이는 고통스러운 골용해성, 조골세포 또는 혼합성 골용해성/조골아세포 병변을 초래합니다. 이러한 병변은 뼈 구조를 손상시키고 병적 골절의 위험을 증가시키며 환자에게 제한된 치료 옵션을 남깁니다. 원발성 뼈 종양은 먼 장기로 전이되며 일부 유형은 다른 골격 부위로 퍼질 수 있습니다. 그러나 최근의 증거에 따르면 많은 고형 종양에서 뼈로 퍼진 암세포가 궁극적으로 다른 장기 시스템으로 전이되는 세포의 주요 공급원이 될 수 있습니다. 원발성 골 종양의 대부분의 동계 또는 이종이식 마우스 모델은 종양 세포 현탁액의 골내(orthotopic) 주사를 수반합니다. 고형 종양에서 골격 전이의 일부 동물 모델은 직접 뼈 주입에 의존하는 반면, 다른 모델은 세포를 혈관 내 또는 원발성 종양의 기관에 주입하여 뼈 전이성 캐스케이드의 추가 단계를 요약하려고 시도합니다. 그러나 이러한 모델 중 어느 것도 안정적으로 또는 100%의 발생률로 뼈 전이를 진행하지 않습니다. 또한, 종양 세포의 직접적인 골내 주사는 폐의 잠재적인 종양 색전술과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 색전성 종양 세포는 생착되지만 전이성 캐스케이드를 재현하지는 않습니다. 우리는 최소 침습 수술 기술을 사용하여 신선하거나 냉동 보존된 종양 조각(종양 세포와 기질로 구성됨)을 근위 경골에 직접 이식하는 골육종의 마우스 모델을 보고했습니다. 이 동물들은 재현 가능한 생착, 성장, 그리고 시간이 지남에 따라 골용해 및 폐 전이를 일으켰습니다. 이 기술은 고형 종양 뼈 전이를 모델링하는 데 사용할 수 있는 다재다능함을 가지고 있으며 하나 또는 여러 세포 유형, 유전자 변형 세포, 환자 유래 이종 이식편 및/또는 광학 또는 고급 이미징으로 추적할 수 있는 표지된 세포로 구성된 이식편을 쉽게 사용할 수 있습니다. 여기에서는 뼈에 고형 종양 이식 이식을 사용하여 원발성 뼈 종양 및 뼈 전이를 모델링하는 이 기술을 시연합니다.
Introduction
인간 및 동물 질병의 마우스 모델은 생물 의학 연구에서 점점 인기를 얻고 있습니다. 이러한 맥락에서 마우스를 사용하는 것의 유용성은 해부학과 생리학이 인간과 매우 유사하다는 것입니다. 이들은 출생 후 성숙기에 이르는 임신 기간과 기간이 상대적으로 짧으며, 개발 또는 구매 비용의 증가가 유전자 변형, 면역결핍 및/또는 인간화의 정도를 증가시키기는 하지만, 상대적으로 저렴한 비용과 주거 용이성과 크게 연관되어 있다1. 근친 교배 균주의 사용은 연구 포함 전에 대체로 균일한 동물 개체군을 초래합니다. 그들의 게놈에 대한 완전한 지식은 인간과 높은 수준의 유사성을 시사합니다. 많은 질병 과정에 대한 상동 분자 표적이 마우스 게놈에서 확인되었으며 현재 쉽게 얻을 수 있는 광범위한 마우스 특이적 시약 라이브러리가 있습니다. 따라서 더 큰 동물 모델과 비교할 때 더 빠르고 저렴한 방식으로 상대적으로 높은 처리량의 분석을 할 수 있는 기회를 제공합니다1. 또한, 특정 유전자를 전 세계적으로 또는 세포 유형 특이적 방식으로 및/또는 구성적으로 또는 유도 가능한 방식으로 과발현 또는 결실시킬 수 있는 유전자 편집 전략의 출현과 함께, 이는 인간 및 동물 질병 조사에 매우 생물학적으로 유용한 모델 시스템을 대표한다2.
암은 마우스 모델이 큰 유용성을 갖는 분야 중 하나입니다. 암의 유전자 마우스 모델은 세포가 발암성 형질전환을 겪기 위해 종양유전자 또는 종양 억제 유전자의 발현 조절에 단독으로 또는 조합하여 의존합니다. 마우스에 원발성 또는 확립 된 종양 세포주를 주입하는 것도 수행됩니다. 인간 또는 생쥐를 포함한 다른 동물 종의 세포주 또는 조직의 도입은 생체 내에서 가장 널리 사용되는 암 모델로 남아 있습니다. 면역이 저하된 마우스에서 이종 종(이종 이식편)의 세포 및 조직을 사용하는 것이 가장 일반적으로 시행된다2. 그러나, 숙주와 수용자가 모두 동일한 종인 동종이식 종양 세포 또는 조직의 사용은 동종 시스템에서 동일한 숙주 마우스 균주와 결합될 때 온전한 면역계와의 상호작용을 허용한다3.
원발성 골 종양 또는 고형 종양으로 인한 골 전이는 고통스러운 골용해성, 조골용해성 병변, 또는 혼합성 골용해성/조골아세포 병변을 초래한다 3,4. 이 종양은 뼈 구조를 손상시켜 병적 골절의 위험을 증가시키고 환자에게 제한된 치료 옵션을 남깁니다. 원발성 뼈 종양은 먼 장기로 전이되며 일부 유형은 다른 골격 부위로 퍼질 수 있습니다. 유방암 환자에서 뼈는 첫 번째 전이의 가장 흔한 부위이며 전이성 질환의 가장 빈번한 첫 번째 부위입니다 5,6. 또한, 파종성 종양세포(disseminated tumor cell, DTCs)는 다른 장기의 전이를 진단하기 전에 골수에 존재하며, 전이의 진행을 예측한다7. 따라서 뼈에 존재하는 암세포는 궁극적으로 다른 장기 시스템으로 전이되는 세포의 원천이라고 믿어집니다. 고형 종양 전이가 주로 폐와 림프절에서 전이가 발생하는 많은 마우스 모델이 존재하며, 종양 유형 및 주사 기술에 따라 잠재적으로 다른 장기 시스템이 발생할 수 있다3. 그러나, 뼈 전이의 마우스 모델은 마우스가 원발성 종양 부담 또는 다른 장기로의 전이로부터 조기 제거 기준에 도달하기 전에 신뢰할 수 있고 재현성 있게 부위 특이적 골격 전이를 생성하고 뼈 전이를 진행하는 것이 부족하다. 우리는 생쥐의 근위 경골에 고형 종양 동종이식편을 외과적으로 이식하는 원발성 골종양 골육종의 모델을 보고했다8. 뼈 종양은 생쥐의 100 %에서 형성되었고 88 %는 폐 전이를 일으켰습니다. 이 전이 발생률은 사람(~20-50%)에서 임상적으로 일반적으로 보고되는 것보다 높지만 폐가 골육종의 가장 흔한 전이 부위이기 때문에 큰 관심을 끌고 있습니다 9,10,11. 이 모델은 원발성 골 종양을 모델링하는 데 유리하지만 유방, 폐, 전립선, 갑상선, 간, 신장 및 위장관 종양과 같은 다른 골성 고형 종양의 뼈 전이를 모델링하는 데에도 큰 유용성을 가지고 있습니다.
이 모델 개발의 근거는 원발성 뼈 종양 또는 뼈 전이를 모델링하기 위해 일반적으로 근위 경골 또는 원위 대퇴골에 전통적인 골내 주사에 대한 대안을 개발하는 것이었다12. 우리의 주요 목표는 이 기술의 알려진 한계, 즉 폐의 종양 색전술을 완화하는 것이었습니다. 그 결과 이러한 색전성 종양 세포의 생착과 폐로 전이되는 확립된 원발성 골 종양으로부터 완전한 전이성 캐스케이드를 요약하지 않는 "인공성 전이"가 발생합니다 8,13. 이것은 또한 확립 된 뼈 전이가 먼 부위로 퍼지는 상황 일 것입니다. 또한, 이 기술은 동소 또는 혈관 내 주사 기술과 비교할 때 뼈와 균일한 부위에서 종양의 생착 및 성장의 더 큰 발생률을 보장하는 뼈 전이 모델을 생성하기 위해 개발되었습니다. 이 모델은 이러한 설명된 기술에 비해 뚜렷한 이점이 있습니다. 이 모델은 종양 세포를 뼈 내로 제어되고 일관되게 전달하는 것을 포함합니다. 또한 폐색전술 후 인공성 폐 전이를 방지하고 기준선 균일 연구 모집단을 설정합니다. 원발성 종양 또는 다른 장기로의 전이로 인한 조기 제거 기준의 위험 없이 이 모델을 사용하면 부위 특이적 종양의 이점이 있습니다. 마지막으로, 이 모델은 환자 유래 이종이식의 사용을 포함하여 수정에 큰 유용성을 가지고 있습니다.
제시된 모델은 외과적 접근 방식에 따라 뼈에 직접 세포 현탁액을 주입한 후 피질을 통해 주사하거나 피질에 작은 결함을 만든 후(수질을 빼내거나 빼지 않고) 골수강으로 전달하는 것과 유사합니다.8,14,15,16,17 . 그러나 종양 동종 이식편을 이식하면이 기술이 뚜렷하게 다릅니다. 따라서 이 보고서의 목적은 이전에 설명된 모델의 많은 한계를 극복하는 원발성 뼈 종양 및 고형 종양으로부터의 뼈 전이의 이 모델을 입증하는 것이었습니다. 세포 배양, 마우스 모델, 마우스 마취 및 수술, 마우스 해부학 경험이 있는 연구 그룹은 마우스의 원발성 뼈 종양 또는 뼈 전이를 모델링하는 기술을 재현할 수 있는 장비를 잘 갖추고 있습니다.
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Protocol
설명된 모든 동물 실험은 영국 케임브리지에 있는 케임브리지 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 세포주의 제조
- 전통적인 세포 배양 또는 생쥐 주입을 위한 실험실의 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 세포주를 성장시킵니다. 여기에 사용된 표준 프로토콜은 10% 소 태아 혈청(FBS), L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신(이하 완전 성장 배지로 알려짐)을 포함하는 Dulbecco의 변형 Eagle's 배지에서의 성장입니다.
참고: 이 실험에서 Abrams 골육종 세포는 Balb/c Foxn1 nu/nu 마우스에 사용됩니다. 유방암 연구의 경우 Balb/c 마우스의 4T1 세포와 C57BL/6 마우스의 EO771 세포가 사용됩니다. - 5%CO2 중 37°C에서 통기된 조직 배양 플라스크 또는 6-웰 조직 배양 플레이트에서 세포를 성장시킵니다.
- 관심있는 세포주를 계대배양하고, 세포가 마우스에 이들 세포를 주입하는 데 통상적으로 사용되는 컨밀도에 도달할 때 주입을 위해 세포를 준비한다.
2. 동물
- 피하 종양 발생을 위해 최소 6-8주령의 Balb/c Foxn1 nu/nu 마우스를 사용하여 동물이 급속한 성장 단계를 넘어 성체 및 골격 성숙을 달성했는지 확인합니다.
- 수컷 또는 암컷 마우스를 사용하십시오. 호르몬 반응성 세포주(예: 암컷 생쥐의 유방암 세포 및 수컷 생쥐의 전립선암 세포)를 선택할 때 예외를 만듭니다.
- 이종이식 실험의 경우, 정상적인 조건에서 온전한 마우스 면역 체계와 호환되지 않는 세포주를 기반으로 하는 면역결핍 무흉선 누드 마우스를 사용합니다.
- 쥐 세포주를 이용한 동종이식 실험의 경우, 이는 또한 이질적인 마우스 유전적 및 면역적 배경을 기반으로 하는 것이 좋습니다. 그러나 syngeneic 실험의 경우 관심 있는 세포주와 동일한 균주의 동물을 사용합니다.
- 기관의 축산 정책에 따라 표준 밀도의 가축을 사육합니다.
3. 피하 종양
- 트립신 처리에 의해 배양물로부터 세포주를 수확하고 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁합니다.
- 세포 생존율을 평가하고 트립판 블루 배제 방법으로 세포 밀도를 결정합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 세십시오. 90%의 최소 세포 생존율은 피하 종양을 생성하기 위해 마우스에 주사하는 데 사용됩니다.
- 1-2 x 105 세포를 0.1 내지 0.15 mL (100 내지 150 μL)의 최종 부피로 멸균된 PBS에 주입하여 세포 밀도를 조정한다. 주사 할 때까지 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
- 대안적으로, 펠렛 세포를 800 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고, 펠렛화된 세포를 희석되지 않은 멸균 기저막 매트릭스 배지에 재현탁하여 0.1 내지 0.15 mL (100 내지 150 μL)의 최종 부피로 1-2 x 105 세포를 수득한다. 더 사용할 때까지 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
- 산소 마취에서 이소플루란으로 피하 종양 성장에 사용할 마우스를 마취합니다. 5L/min 산소에 2% 이소플루란의 유도 용량을 사용하고 2L/min 산소에 3-2% 이소플루란의 유지 용량을 사용하십시오. 계속 진행하기 전에 깜박임이나 페달 반사가 없는지 확인하십시오.
참고: 이소플루란은 흡입 마취제입니다. 적절한 청소 및 무료 가스 수집 시스템이 있는 환기가 잘 되는 장소에서 이소플루란을 사용하십시오. 기관 수의사와 상의하여 마취 유도, 유지 관리 및 모니터링 계획을 개발하고 실험실 직원이 마취 모니터링 및 흡입 마취제 취급에 대한 적절한 교육을 받았는지 확인하십시오. - 탈모 용액 또는 전기 클리퍼로 마취 된 생쥐의 흉부 또는 복부의 등쪽 부위에서 머리카락을 제거하십시오. 피부에 대한 잠재적인 외상을 최소화하기 위해 제모 용액이 선호됩니다. 무흉선 누드 마우스를 사용하는 경우 이 단계를 건너뜁니다.
- 세포 현탁액을 주입하기 전에 70% 에탄올 면봉으로 준비된 부위를 세척합니다.
- 27G 바늘이 있는 1mL 투베르쿨린 주사기를 사용하여 견갑골의 움직임에 영향을 받지 않도록 흉부 또는 복부의 등쪽 부위에 세포를 피하 주사합니다. 대안적으로, 시판되는 세포외 기질에 현탁액으로서 세포를 피하 주사한다.
참고: 상업적으로 이용 가능한 세포외 기질에 주입하면 이러한 기질이 실온에서 응고되기 때문에 피하 공간에서 세포 현탁액의 이동이 제한됩니다. - 보행이 가능할 때까지 개별 케이지의 가열 패드에서 마우스를 회수하십시오. 그런 다음 마우스를 깨끗하고 건조한 침구로 일반 케이지에 넣을 수 있습니다.
- 캘리퍼스로 등쪽 흉부 또는 복부 위에 있는 피하 종양의 크기를 모니터링하고 매주 체중을 측정하여 피하 종양이 궤양을 일으키지 않거나 마우스가 기관의 동물 관리 및 사용 위원회에서 설정한 조기 제거 기준을 충족하는지 확인합니다. 피부 궤양이나 중심 종양 괴사의 위험을 줄이기 위해 모든 치수에서 최대 15mm의 종양 크기를 권장합니다.
참고: 현지 지침을 참조하여 최대 허용 종양 크기/부피를 결정하십시오. - 3 내지 4주 후에 피하 종양을 갖는 마우스를CO2 흡입에 의한 후 자궁경부 탈구에 의해 안락사시킨다. 마우스 안락사에 대한 기관의 허용 가능한 정책을 따르십시오.
- 무균 수술 기술을 사용하여 피하 종양을 채취합니다. 모발을 제거한 후 70 % 에탄올로 종양 위에있는 피부를 이전과 같이 소독하십시오 (해당되는 경우). #15 메스 블레이드(메스 블레이드 핸들 유무에 관계없이)로 종양 위에 있는 피부를 절개합니다. 멸균 수술 용 가위로 주변의 부착 된 연조직에서 종양을 날카롭게 해부하십시오.
- 종양을 완전한 성장 배지가 들어 있는 6웰 조직 배양 플레이트에 넣고 미리 결정된 크기의 여러 개의 작은 조각(~ 0.6mm x 0.6mm x 0.6mm – 0.25mm3 에서 최대 1mm x 1mm x 1mm x 1mm – 1mm3) #15 메스 블레이드(메스 블레이드 핸들 포함 또는 제외).
- 종양 단편을 경골 내 이식 시점까지 실온에서 멸균 완전 성장 배지에 유지합니다. 루시페라아제 또는 형광 리포터 유전자를 운반하는 세포주의 경우, 생체 외 생체발광 또는 형광 이미징을 사용하여 마우스에 경골내 이식하기 전에 종양 생존력을 확인합니다.
- 냉동 보존을 위해 20% FBS 및 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)가 보충된 완전한 성장 배지에 동일한 극저온 혼합물에 여러 단편을 넣습니다. 상업용 냉동 보존 시스템을 사용하여 –80°C에서 점진적으로 동결하고 액체 질소에 장기간 보관합니다. 액체 질소 침지를 사용하여 급속 냉동하여 후속 분석을 위해 종양 단편을 보존하되 향후 이식을 위해 보존하지 마십시오. 이러한 냉동 종양 단편을 -80°C에서 장기간 보관하십시오.
참고: 스냅 동결 종양은 생체 내에서 생착 및 성장하지 않는다는 것이 이전에 보고되었습니다8.
4. 피하 종양 조각의 외과 적 이식
- 외과적 이식 전에 완전한 성장 배지에서 피하 종양의 신선하거나 냉동보존된 단편을 실온으로 가져옵니다.
- 섹션 3에 설명된 바와 같이 산소 마취에서 이소플루란을 사용하여 관심 균주의 마우스를 마취합니다. 계속하기 전에 페달 반사가 부족한지 확인하십시오. 수술 전후 진통을 제공하기 위해 0.02-0.05 mg/kg의 용량으로 피하 부프레노르핀을 투여합니다. 필요한 경우 수술 후 6-8 시간마다 반복 할 수 있습니다.
- 오른쪽 무릎 관절과 뒷다리의 근위 경골의 털을 제모 용액으로 제거하여 피부에 대한 잠재적 외상을 최소화하십시오.
- 수술 용 방부제로 준비된 부위를 문지릅니다. 먼저 70% 에탄올 면봉으로 문지른 다음 클로르헥시딘과 식염수 스크럽을 번갈아 가며 문지릅니다.
- 근위 경골을 무릎 관절의 원위 부위로 시각화하고 관절을 구부리고 확장합니다.
- #3 메스 블레이드(메스 블레이드 핸들 유무에 관계없이)를 사용하여 사지 내측의 근위 경골 수준에서 4-15mm 절개를 만듭니다. 근위 경골의 내측 피질을 노출시키기 위해 피부와 피하 조직을 절개합니다.
- 25G 바늘 끝으로 부드러운 압력을 가하고 끝을 회전시켜 근위 경골의 내측 피질에 작은 구멍을 만듭니다. 이 구멍을 두개골과 꼬리 경골 피질 사이의 등거리 지점에서 무릎 관절 원위까지 약 2mm 만듭니다. 종양 조각의 크기에 따라 바늘 크기를 선택하십시오.
- 멸균 집게를 사용하여 종양 조각을 집어 근위 경골의 수질강에 삽입하십시오. 27-30G 바늘을 사용하여 종양 조각을 수질관으로 조작합니다. 종양 조각의 크기에 따라 각 경골에 최소 0.5mm3 의 총 종양 부피를 이식합니다. 이것은 생성 된 종양 조각의 크기에 따라 1 개 이상의 종양 조각의 이식이 필요할 수 있습니다.
참고: 뼈 외부에서 이식편의 변위를 방지하거나 제한하기 위한 수정은 뼈 결손에 뼈 왁스 또는 뼈 시멘트를 배치하거나 뼈의 구멍 위에 젤 폼 또는 피하 지방 이식편을 배치하는 것입니다. - 멸균 액체 조직 접착제 또는 단일 피부 봉합사로 피부 가장자리를 바르십시오. 이 부위에 상처 클립을 사용하지 마십시오. 수술 후 형광 이미징을 사용하는 경우 조직 접착제와 봉합사 모두 형광을 발할 가능성이 있으므로 주의하십시오.
- 보행이 가능할 때까지 개별 케이지의 가열 패드에서 마우스를 회수하십시오.
5. 시리얼 및 엔드포인트 평가
- 이전에 설명한 바와 같이 산소 마취에서 isoflurane을 사용하여 마우스를 마취시킵니다.
- 매주 디지털 방사선 촬영, 생물발광 또는 형광 이미징(루시페라아제 또는 형광 리포터 유전자를 발현하는 세포를 사용하는 경우)을 통해 비침습적으로 경골 종양 성장을 평가합니다. 이식 부위의 사지의 캘리퍼스 측정은 깨어있는 마우스에서도 수행 할 수 있습니다.
- 종양이 있는 마우스(체중, 활동 수준, 호흡수, 몸단장, 자세, 정신 및 행동)에 대한 전통적인 모니터링 외에도 뒷다리 파행, 부기 및 수술 부위 감염의 징후에 대해 매주 마우스를 모니터링합니다.
- 피부 상처가 치유될 때까지 처음 10-14일 동안 피부 수술 상처에 과도한 발적, 부기, 배액 및 상처 열개에 대해 모니터링합니다. 4-5주 후, 연구 결과 평가에 따라 마우스를 살아 있거나 안락사 후에 평가합니다.
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Representative Results
양성 결과는 시간 경과에 따른 종양 생착 및 진행성 종양 성장과 관련이 있습니다. 종양 유형에 따라 골내 종양 성장은 진행성 뒷다리 파행과 관련이 있을 수 있지만 많은 종양은 수반되는 뼈 질환의 징후에도 불구하고 파행을 유발하지 않습니다. 성공적인 생착은 고급 영상으로 문서화되었으며, 이에 따라 관심 세포주의 뼈 표현형(골용해성, 조골세포 또는 혼합 골용해성/조골아세포 전이)과 관련된 근위 경골에 진행성 방사선사진, μCT 또는 μMRI 변화가 있을 것입니다(그림 1)8. 이전 보고서에서 종양 이식 이식을 위해 생성된 피질 결손은 이식 1주일 후 근위 경골에서 볼 수 있었습니다(그림 1A). 2주차까지 피질 결손에 인접한 눈에 띄는 골용해 및 뼈 리모델링이 있었습니다. 2주에서 5주까지 종양 생착 및 성장과 관련된 점진적인 뼈 파괴 및 새로운 뼈 형성이 있었습니다(그림 1B-E). 리포터 유전자가 있는 세포주의 경우 뼈의 변화는 시간이 지남에 따라 형광 또는 생물발광 이미징 출력의 증가를 동반합니다. 급성 절름발이는 임박하거나 실제 병적 골절의 지표일 수 있으므로 마우스에 대한 즉각적이고 신중한 방사선 평가가 필요하고 연구에서 조기 제거될 수 있습니다. 연구되는 종양 세포주에 따라 뼈 파괴가 전이보다 훨씬 앞서 빠르게 발생할 수 있습니다. 이것은 임상적으로 관련된 전이, 즉 폐로의 전이가 발생하기 전에 마우스를 연구에서 제거해야 할 수 있기 때문에 원발성 뼈 종양과 관련된 연구에서 특히 중요합니다. 이러한 경우, 이전에 보고한 바와 같이 원발성 뼈 종양을 사용할 때 최소 잔류 질환 및 후속 전이에 대한 연구를 허용하기 위해 종양이 있는 사지의 외과적 절단이 권장됩니다 4,8. 사람의 완전한 뒷다리 절단은 일반적으로 수행되지 않지만, 이것은 수의학의 표준 치료이며, 인간과 개 골육종의 임상 및 분자 특성의 유사성이 잘 문서화되어 있습니다. 따라서 생쥐의 뒷다리 절단은 많은 동물 세포주와 관련이 있습니다. 또한, 절단은 생쥐와 같은 작은 설치류에서는 사람에게 사용되는 사지 보존 절차를 달성할 수 없기 때문에 생쥐에서 실행 가능한 치료 방법입니다. 원발성 뼈 종양을 가진 마우스에서 식욕 부진, 점진적인 체중 감소, 전반적인 신체 상태 불량 및 호흡 곤란 (증가 된 속도 또는 노력)은 폐 및 기타 기관으로의 종양 전이의 진행을 알릴 수 있습니다. 전이를 확인하기 위해 생물발광 영상, μCT 또는 μMRI 영상으로 확인하는 것이 권장되며 영향을 받은 동물은 안락사시켜야 합니다.
이식된 경골의 방사선 촬영 또는 μCT 검사에서 진행성 변화(연구 중인 세포주에 따라 골용해성, 조골세포 또는 혼합 골용해성/조골세포 병변)의 증거가 없는 경우 종양 생착의 부족으로 인해 발생할 가능성이 가장 높은 음성 결과를 의심해야 합니다. 리포터 유전자를 운반하는 세포주의 경우, 광학 이미징에 의해 시간이 지남에 따라 형광 또는 생물발광 신호 전달이 증가하지 않는 것도 종양이 생착에 실패했다는 결론을 뒷받침할 것입니다. 생착이 부족하거나 불량하면 수술 부위 감염과 관련될 수 있습니다. 그러나 이것은 수술 후 초기(수술 후 처음 1-2주)에 가장 흔하게 발적, 부기 또는 분비물과 같은 특정 임상 징후를 나타냅니다. 동물은 또한 잠재적으로 열이 날 수 있으며 수술 부위 감염으로 인해 수술 후 초기에 활동 부족 또는 구부정한 자세를 보일 수 있습니다. 사지의 준비 및 적절한 멸균 준비 동안 멸균 조건 하에서 동종 이식편을 수확 및 유지, 멸균 수술 중 기술 및 완전한 상처 봉합은 감염 및 종양 생착 실패를 초래하는 수술 후 수술 상처 합병증의 가능성을 최소화합니다.
이전 보고서8에서 보고된 파일럿 연구와 최종 연구를 모두 포함할 때 골육종 조각을 이식한 16마리의 마우스 중 16마리(100%)가 골용해성 뼈 병변으로 진행되었고 이 16마리 중 14마리(88%)가 전이를 일으켰습니다. 모든 전이는 폐로 관찰되었고 빠르면 이식 후 3주에 조직학으로 진단되었다8. 이식 후 1주(n=2) 및 2주(n=2)주에 부검된 추가 동물은 폐 전이의 증거를 나타내지 않았습니다.
그림 1: 연속 방사선 촬영. 원발성 골종양 세포주(골육종)를 사용하여 피하 종양 동종이식의 경골내 이식 후 (A) 1, (B) 2, (C) 3, (D) 4 및 (E) 5주에서 매주 연속 방사선 촬영(순서대로)을 수행했습니다. 시간이 지남에 따라 종양 생착 및 성장과 관련된 점진적인 뼈 파괴 및 새로운 뼈 형성이 있었습니다. 이 수치는 ref8의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 보고서는 종양 동종이식편의 경골내 이식 후 원발성 뼈 종양 또는 뼈 전이를 생성하기 위한 우리의 모델을 문서화합니다. 우리는 이 과정에서 몇 가지 중요한 단계가 있다고 믿습니다. 종양 세포 현탁액의 피하 주사와 결과 종양 조각의 경골 내 배치 모두에 대해 안전한 마취 평면이 설정되어야합니다. 피하 동종 이식편 제거와 동종 이식편의 경골 내 배치를 위해 수술 부위를 멸균 준비해야합니다. 종양 동종 이식편 단편은 후속 경골 내 이식을 위해 균일하게 생성되어야합니다. 종양 조각의 이식을 위해 근위 경골에 적절한 크기의 결손을 만들어야합니다. 수술 후 상처 합병증의 위험을 줄이기 위해 수술 피부 상처를 완전히 봉합해야 합니다. 마지막으로 중요한 단계는 세포외 기질이 피하 주사를 위한 종양 세포 현탁액의 일부로 사용되는 경우 주사 전에 현탁액이 응고되는 것을 방지하기 위해 제조업체에서 권장하는 취급 지침을 사용해야 한다는 것입니다. 사지의 적절한 멸균 준비, 멸균 수술 중 기술 및 완전한 상처 봉합은 수술 후 수술 상처 합병증의 가능성을 최소화합니다.
이식된 종양의 특징과 수술 기법은 연구 모집단에 통합하기 위한 성공적이고 재현 가능한 결과를 얻는 데 매우 중요합니다. 처음에는 종양 이종 이식편/동종이식편이 경골의 수질강에 직접 이식되어 종양 조직이 뼈 내부에 완전히 있는지 확인해야 합니다. 뼈 외부의 이식편 변위를 방지하거나 제한하기 위한 수정은 초기에 뼈 결손에 뼈 왁스 또는 뼈 시멘트를 배치하거나 뼈의 구멍 위에 겔 폼 또는 피하 지방 이식편을 배치하는 것입니다. 대안은 두개골 경골 근육 아래에 생성 된 근위 경골의 측면에있는 구멍을 통해 종양 동종 이식편을 삽입하는 것입니다. 두개골 경골 근육의 존재는 뼈 결함에 대한 생물학적 덮개 역할을 하여 종양 동종이식의 잠재적 변위를 제한합니다. 그러나 이것은 근위 경골의 측면 측면에서 신경근 외상의 가능성이 있는 보다 공격적인 외과적 접근 방식입니다. 이식 전에 종양 동종 이식편이 균일 한 크기로 만들어 지도록주의를 기울여야합니다. 즉, 종양 동종이식은 어떤 차원에서도 1mm를 초과해서는 안 되는데, 이는 이식 시 이식편에 직접적이고 즉각적인 혈관 공급이 제공되지 않을 때 생물학적 시스템에서 더 큰 종양 크기가 더 작은 이식편보다 생착될 가능성이 적기 때문입니다. 우리는 0.5mm3의 최종 이식된 종양 부피로 성공적인 결과를 보고했지만 최대1mm3의 결합된 종양 단편 부피가 성공적인 결과를 얻을 것으로 예상합니다. 그러나, 최대 이식 가능한 종양 단편 부피는 결정되지 않았다. 냉동보존된 조직과 비교할 때, 신선한 종양 이종이식 및 동종이식편이 생존할 가능성이 더 높지만, 신중하게 냉동보존된 종양 동종이식편을 사용하는 관행에 문제가 관찰되지는 않았습니다. 스냅 냉동 동종 이식편은 이식해서는 안됩니다. 또한, 피하 종양의 캡슐 및 외부 부분의 절개는 종양의 이러한 층으로부터의 어떠한 기여도 방지할 것이며, 이는 주로 적절한 종양 세포로 구성되기보다는 상당한 면역 침윤을 갖는 섬유성 및 혈관이다. 메스 블레이드를 사용하여 더 큰 종양 덩어리에서 직접 종양 동종이식편을 생성하는 또 다른 방법은 이식 전에 미리 정의된 길이로 절단할 수 있는 원통형 종양 "코어"를 생성하는 작은 생검 바늘을 사용하는 것입니다. 생검 바늘 또는 코어 생검 펀치를 사용하면 이식을 위한 균일한 종양 단편을 만드는 데 도움이 될 수 있는데, 이는 생검 과정에서 두 개의 균일한 치수(너비 및 깊이)가 생성된 후 이식 전에 적절한 길이로 절단할 수 있기 때문입니다. 루시페라아제 또는 형광 단백질과 같은 리포터 유전자가 이식된 종양 세포에 사용되는 경우, 이식 시 또는 이식 후 1주일 후 종양 단편의 평가는 이식된 종양 단편에서 종양 세포의 상대적 기여도와 생존력을 나타냅니다.
다른 절차와 마찬가지로 이 기술의 보고된 이점 외에도 제한 사항이 있습니다. 전이는 세포외 기질을 통한 침입 및 이동을 성공적으로 실행하고, 종양의 혈액 공급을 혈관 내로 내밀고, 최종 전이 목적지에 도달할 때까지 순환 중에 생존하고, 적절한 장기로 유출된 다음 휴면 상태에 머물거나 증식하여 전이성 병변을 생성해야 하는 다단계 과정입니다. 임상적으로 검출 가능한 전이가 되도록 정상 조직 구조의 변형18. 현재 사용되는 뼈 전이 마우스 모델은 원발성 종양의 정상 부위에 종양 세포를 직접 동소 주사하거나, 심장의 좌심실 또는 꼬리 정맥(외측 또는 등쪽 꼬리 정맥)에 말초적으로 혈관내 주사하거나, 종양 세포 현탁액의 직접 골내 주사에 크게 의존한다3. 그러나, 뼈 전이 모델을 개선하려는 최근의 보고들은 장골, 꼬리 또는 대퇴 동맥으로의 주사를 옹호하고 있다 19,20,21. 이러한 모든 방법은 직접 골내 주사 또는 우리의 경우 최종 조직 변형만을 모델링하는 종양 동종이식 이식을 제외하고 뼈 전이성 캐스케이드 내에서 하나 이상의 단계를 통합합니다. 따라서 이것은 우리 기술의 고유한 한계 중 하나입니다. 추가의 한계는 현재 기술된 바와 같이, 중간 마우스 숙주에서 동종이식편을 증식시키는 것을 필요로 하며, 이는 추가적인 마우스의 사용을 필요로 하고, 100% 순수한 종양 세포가 아닌 종양의 이식을 초래한다는 것이다. 동종 이식편은 피하 위치에서 자라는 종양에 의해 제공되는 약간의 간질 기여를 가질 것입니다. 이러한 피하 기질 기여를 최소화하기 위한 잠재적인 대안은 세포외 기질 또는 스캐폴드와 같은 생물학적 기질에 세포를 피하 주사하는 것입니다. 대안적으로, 종양의 원발성 부위로의 동소 주입 후, 종양 제거 및 이식편 제제가 수행될 수 있다.
이 보고서에 요약된 방법은 종양 세포의 직접 골내 주사 후 원발성 뼈 종양 또는 뼈 전이를 모델링하는 기존 방법과 비교할 때 주요 이점이 있습니다. 논의된 바와 같이, 우리와 다른 사람들은 폐의 직접적인 색전술과 세포 현탁액의 경골내 주사 후 때때로 즉각적인 사망을 관찰했습니다 8,13. 이것은 종양 세포를 골수강에 가압으로 주입한 후 종양 세포가 골수 혈관 정현파를 통해 말초 혈액 공급으로 들어가 정맥 복귀에 의해 폐로 운반되기 때문에 발생합니다. 이러한 사건은 사람과 동물의 전체 관절 성형술과 관련된 골수강에 임플란트를 가압으로 배치하는 것과 관련된 폐 또는 정맥 혈전 색전증에서 관찰되는 것과 기계적으로 비슷합니다. 우리와 다른 사람들은 폐에 대한 이 색전증 현상이 세포주에 특이적일 수 있다는 가설을 세웁니다(미공개 관찰). 그러나, 이러한 색전성 인공물 전이(embolic artifactual metastases)의 생성을 제한하는 매우 상세한 단계들이 보고되었다12. 처음에는 적절한 트립신 처리와 주사를 위한 균일한 단일 세포 현탁액의 생성이 있어야 하며, 이는 세포 덩어리를 방지하기 위해 얼음에 보관해야 합니다. 바늘은 근위 경골 성장판을 통해 적절하게 배치되어야 하며, 그 후에 작은 주입량(~10μL)과 골수강에 무저항 주사를 수행해야 합니다. 그럼에도 불구하고, 폐 및 다른 장기로의 종양 세포 전달은 골내 및 혈관내 주사 기술에 따른 생물발광 이미징에 의해 쉽게 관찰될 수 있으며, 이는 폐 및 기타 기관에서 이러한 생체발광 신호를 생성하는 세포가 원격 전이를 일으킬 수 있음을 시사합니다(미공개 관찰)3. 우리는 이 기술의 또 다른 이점이 단일 종양이 연구 집단 내의 균일한 뼈 부위에서 자라서 동물 간 변동성을 감소시킨다는 것을 발견했습니다. 이를 통해 균일한 연구 모집단을 설정하고 치료 그룹 간의 준비를 할 수 있습니다. 이는 동소 또는 혈관 내 주사 후 발생하는 뼈 전이와는 대조적으로, 세포가 다른 골격 부위로 전이되고 다른 동역학으로 성장할 수 있어 연구 그룹 간의 비교가 어렵습니다. 종양 동종이식편 이식 후 한 해부학적 부위에서의 종양 성장은 또한 혈관내 및 동소 주사 기술에서 볼 수 있듯이 다른 장기 시스템으로의 전이 또는 원발성 종양 부담으로 인해 마우스가 제거될 가능성을 방지합니다. 또한, 종양 동종이식 이식 후 100% 생착을 관찰했으며, 이는 균일한 연구 모집단을 지원하고 적절한 표본 크기 수를 달성하기 위해 추가 마우스의 불필요한 사용을 방지합니다. 이것은 또한 종양 세포 현탁액을 뼈에 경피 주사한 후 불완전하고 부정확한 주입의 한계를 극복합니다.
이 기술은 다재다능 함이 뛰어나 현재 우리 연구에 사용되고있는 수정을 가져 왔으며 향후 응용 분야에 큰 유용성을 발휘할 가능성이 있습니다. 처음에는 근위 경골을 골내 이식 부위로 사용하는 동안 원위 대퇴골 및 근위 상완골을 포함하되 이에 국한되지 않는 원발성 뼈 종양 또는 뼈 전이의 다른 일반적인 부위를 쉽게 사용할 수 있습니다. 그러나 이러한 부위와 골반 및 척추와 같은 부위에 대한 외과적 접근은 근위 경골과 비교할 때 점진적으로 더 광범위한 외과적 접근이 필요합니다. 또한 골반, 척추, 두개골, 요골 및 척골과 같은 부위는 종양 이식을 위한 적절한 뼈 스톡의 이점을 얻지 못합니다. 구강 종양과 같은 뼈 침습성 악성 종양의 경우, 뼈에 인접하거나 구인두 내에 종양 동종 이식편을 배치하는 것도 침윤성 종양의 진행을 요약할 수 있습니다 3,22. 시험관 내 및 생체 내 실험은 종종 관심 세포 유형에 대한 다양한 세포 유형의 영향을 결정하기 위해 공동 배양 또는 공동 주입 기술을 사용합니다. 따라서 두 개 이상의 세포 유형을 동시에 주입하여 피하 종양을 생성할 수 있는 가능성이 존재하며, 이 기술을 사용하여 뼈에 이식할 수 있습니다. 유전자 변형 세포는 종양 동종이식편을 생성하기 위해 단독으로 또는 다른 정상 또는 유전자 변형 세포와 조합하여 사용할 수 있습니다. 정밀 의학에 대한 관심이 높아지고 인간 암의 시험관 내 및 생체 내 모델이 생성됨에 따라 환자 유래 생쥐 이종 이식이 인기를 얻고 있습니다. 최근에, 유방암 뼈 전이의 모델이 누드 마우스에 피하로 이식된 인간 뼈 디스크에 직교적으로 이식된 환자 유래 이종이식 모델이 설명되었습니다23. 이로부터 환자 유래 이종이식은 피하 증식을 위한 중간 숙주 없이 우리 모델을 사용하여 뼈에 직접 이식할 수 있습니다. 이를 통해 종양 동역학을 신속하게 평가하고 동종이식 준비를 위해 큰 종양 덩어리가 필요하지 않은 단일 환자 생검에서 잠재적으로 여러 치료 조합을 평가할 수 있습니다. 암 연구에서 오가노이드의 사용 증가는 모델24에서도 사용될 수 있습니다. 이것은 경골 피질의 구멍을 통해 이러한 세포 응집체의 바늘 또는 피펫 주입이 필요합니다. 따라서 우리는 뼈와 골수강 외부로 오가노이드 이동의 가능성을 제한하기 위해 피질 결함(위에서 논의한 바와 같이)의 밀봉을 권장합니다. 지금까지 살펴본 바와 같이, 광학(생물발광 또는 형광) 또는 고급(디지털 방사선 촬영, μCT 또는 μMRI) 영상으로 세포를 표지하고 추적하여 시간 경과에 따른 종양 성장을 평가할 수 있습니다. 이것은 또한 시간이 지남에 따라 동일한 동물이 이미지화되기 때문에 동물 수를 최소화하는 이점이 있습니다.
요약하면, 이 보고서는 뼈에 고형 종양 이식편 이식을 사용하여 원발성 뼈 종양 및 뼈 전이를 모델링하는 우리의 기술을 보여줍니다.
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Disclosures
Hildreth 박사는 수상 번호 K01OD026527로 NIH의 자금 지원을 받았습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Acknowledgments
저자는 이 기술의 개발에 대한 Dr. Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP의 중요한 공헌을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 scalpel blade | Henry Schein Ltd. | 75614 | None |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture |
| Abrams osteosarcoma cell line | Not applicable | Not applicable | None |
| Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) | VetEquip | 901805 | None |
| Animal weighing scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | None |
| BALB/c nude mouse (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8 weeks of age. Male or female mice |
| Bone cement | Depuy Synthes | 160504 | Optional use instead of bone wax |
| Bone wax | Ethicon | W31G | Optional |
| Buprenorphine | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats |
| Carbon dioxide euthanasia station | N/A | N/A | Should be provided within animal facility |
| Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide | Heraeus | Various | None |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetoquinol | 411412 | None |
| Cryovials (2 ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| D-luciferin (Firefly), potassium salt | Perkin Elmer | 122799 | Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene |
| Digital caliper | Mitutoyo | 500-181-30 | Can be manual |
| Digital microradiography cabinet | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | Optional to evaluate bone response to tumor growth |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | None |
| Ethanol (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | None |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | None |
| Forceps, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | None |
| Freezer (– 80 °C) | Sanyo | MDF-794C | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | Can also use automated cell counter, if available |
| Hypodermic needles (27 gauge) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles |
| Ice | N/A | N/A | Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage |
| Iris scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Ltd. | 1182098 | None |
| IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system | Perkin Elmer | CLS136334 | Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes |
| L-glutamine | Thermofisher scientifc | 25030081 | None |
| Liquid nitrogen | British Oxygen Corporation | NA | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Liquid nitrogen dewar, 5 litres | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | Optional. Also available in 10 ml size (354230) |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes |
| Mr. Frosty freezing containiner | Fisher Scientific | 10110051 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | Can alternatively use an electric clipper with fine blade |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | None |
| Scalpel handle, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | User preference as long as it accepts #15 scalpel blade |
| Small animal heated pad | VetTech | HE006 | None |
| Stereomicroscope | GT Vision Ltd. | H600BV1 | None |
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine |
| Tissue adhesive (sterile) | 3M Corporation | 84-1469SB | Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size) |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | None |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | Use 0.05%-0.25% |
| Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) | Becton Dickinson | 309659 | Slip tip preferred over Luer |
| Vented tissue culture flasks, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | Can also use smaller or larger flasks, as needed |
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