Summary
Los modelos de metástasis óseas no desarrollan metástasis de manera uniforme o con una incidencia del 100%. La inyección directa de células tumorales intraóseas puede resultar en la embolización del pulmón. Presentamos nuestra técnica de modelado de tumores óseos primarios y metástasis óseas utilizando la implantación de injerto de tumor sólido en el hueso, lo que lleva a un injerto y crecimiento reproducibles.
Abstract
Los tumores óseos primarios o metástasis óseas de tumores sólidos producen lesiones osteolíticas, osteoblásticas o mixtas osteolíticas/osteoblásticas. Estas lesiones comprometen la estructura ósea, aumentan el riesgo de fractura patológica y dejan a los pacientes con opciones de tratamiento limitadas. Los tumores óseos primarios hacen metástasis a órganos distantes, con algunos tipos capaces de diseminarse a otros sitios esqueléticos. Sin embargo, la evidencia reciente sugiere que con muchos tumores sólidos, las células cancerosas que se han diseminado al hueso pueden ser la fuente principal de células que finalmente hacen metástasis a otros sistemas de órganos. La mayoría de los modelos de ratón singénico o xenoinjerto de tumores óseos primarios implican la inyección intraósea (ortotópica) de suspensiones de células tumorales. Algunos modelos animales de metástasis esqueléticas de tumores sólidos también dependen de la inyección ósea directa, mientras que otros intentan recapitular pasos adicionales de la cascada metastásica ósea inyectando células por vía intravascular o en el órgano del tumor primario. Sin embargo, ninguno de estos modelos desarrolla metástasis óseas de forma fiable o con una incidencia del 100%. Además, se ha demostrado que la inyección intraósea directa de células tumorales está asociada con una posible embolización tumoral del pulmón. Estas células tumorales embólicas se injertan pero no recapitulan la cascada metastásica. Se informó un modelo de ratón de osteosarcoma en el que se implantan fragmentos tumorales frescos o criopreservados (que consisten en células tumorales más estroma) directamente en la tibia proximal mediante una técnica quirúrgica mínimamente invasiva. Estos animales desarrollaron injertos reproducibles, crecimiento y, con el tiempo, osteólisis y metástasis pulmonares. Esta técnica tiene la versatilidad de ser utilizada para modelar metástasis óseas tumorales sólidas y puede emplear fácilmente injertos que consisten en uno o múltiples tipos de células, células genéticamente modificadas, xenoinjertos derivados de pacientes y / o células marcadas que pueden rastrearse mediante imágenes ópticas o avanzadas. Aquí, demostramos esta técnica, modelando tumores óseos primarios y metástasis óseas utilizando la implantación de injerto de tumor sólido en el hueso.
Introduction
Los modelos de ratón de enfermedades humanas y animales son cada vez más populares en la investigación biomédica. La utilidad de usar ratones en este contexto es que su anatomía y fisiología son muy similares a las de los humanos. Tienen un período de gestación relativamente corto y un tiempo en la vida postnatal para alcanzar la madurez, y se asocian en gran medida con un costo relativamente bajo y facilidad de vivienda, aunque los crecientes costos de desarrollo o compra se asocian con mayores grados de modificación genética, inmunodeficiencia y / o humanización1. El uso de cepas endogámicas da como resultado una población animal en gran medida uniforme antes de la inclusión en el estudio. Un conocimiento completo de su genoma sugiere un alto grado de similitud con los humanos. Se han identificado objetivos moleculares ortólogos para muchos procesos de enfermedad en el genoma del ratón y ahora existe una extensa biblioteca de reactivos específicos para ratones que se pueden obtener fácilmente. Por lo tanto, brindan la oportunidad de un análisis de rendimiento relativamente alto de una manera más rápida y menos costosa en comparación con los modelos animales más grandes1. Además, con el advenimiento de estrategias de edición genética que permiten la sobreexpresión o eliminación de ciertos genes, ya sea globalmente o de una manera específica del tipo celular y / o constitutivamente o de manera inducible, representan un sistema modelo muy útil biológicamente para la investigación de enfermedades humanas y animales2.
El cáncer es un campo en el que los modelos de ratón tienen una gran utilidad. Los modelos genéticos de cáncer en ratones se basan en la modulación de la expresión de oncogenes o genes supresores de tumores, solos o en combinación, para que las células experimenten una transformación oncogénica. También se realiza la inyección de líneas celulares tumorales primarias o establecidas en ratones. La introducción de líneas celulares o tejidos de humanos u otras especies animales, incluidos ratones, sigue siendo el modelo de cáncer in vivo más utilizado. El uso de células y tejidos de especies disímiles (xenoinjertos) en ratones inmunocomprometidos se realiza con mayor frecuencia2. Sin embargo, el uso de células tumorales de aloinjerto o tejidos donde tanto el huésped como el receptor son de la misma especie permite la interacción con un sistema inmune intacto cuando se combina con la misma cepa de ratón huésped en sistemas singénicos3.
Los tumores óseos primarios o metástasis óseas de tumores sólidos dan lugar a lesiones osteolíticas, osteoblásticas o mixtas osteolíticas/osteoblásticas, dolorosas 3,4. Estos tumores comprometen la estructura ósea, aumentando el riesgo de fractura patológica y dejan a los pacientes con opciones de tratamiento limitadas. Los tumores óseos primarios hacen metástasis a órganos distantes, con algunos tipos capaces de diseminarse a otros sitios esqueléticos. En pacientes con cáncer de mama, el hueso es el sitio más común de la primera metástasis y el primer sitio de presentación más frecuente de la enfermedad metastásica 5,6. Además, las células tumorales diseminadas (DTC) están presentes en la médula ósea antes del diagnóstico y predicen el desarrollo de metástasis en otros órganos7. Por lo tanto, se cree que las células cancerosas presentes en el hueso son la fuente de células que finalmente hacen metástasis a otros sistemas de órganos. Existen muchos modelos de ratón de metástasis tumorales sólidas que desarrollan metástasis predominantemente en el pulmón y los ganglios linfáticos, y dependiendo del tipo de tumor y la técnica de inyección, potencialmente otros sistemas de órganos3. Sin embargo, faltan modelos de metástasis ósea en ratones que produzcan metástasis esqueléticas específicas del sitio de manera confiable y reproducible y desarrollen metástasis óseas antes de que los ratones alcancen los criterios de eliminación temprana de la carga tumoral primaria o metástasis a otros órganos. Hemos reportado un modelo del osteosarcoma tumoral óseo primario que se basa en la implantación quirúrgica de un aloinjerto tumoral sólido en la tibia proximal de ratones8. Los tumores óseos se formaron en el 100% de los ratones y el 88% desarrollaron metástasis pulmonar. Esta incidencia de metástasis excede lo que comúnmente se informa clínicamente en personas (~ 20-50%), pero es de gran interés ya que el pulmón es el sitio más común de metástasis para el osteosarcoma 9,10,11. Si bien este modelo es ventajoso para modelar tumores óseos primarios, también tiene una gran utilidad para modelar metástasis óseas de otros tumores sólidos osteotrópicos como tumores de mama, pulmón, próstata, tiroides, hígado, riñón y gastrointestinales.
La justificación para el desarrollo de este modelo fue desarrollar una alternativa a la inyección intraósea tradicional típicamente en la tibia proximal o el fémur distal para modelar tumores óseos primarios o metástasis óseas12. Nuestro objetivo principal era aliviar una limitación conocida de esta técnica, es decir, la embolización tumoral del pulmón. Esto resulta en el injerto de estas células tumorales embólicas y "metástasis artificarias" que no recapitulan la cascada metastásica completa de un tumor óseo primario establecido que hace metástasis a los pulmones 8,13. Esta también sería la situación cuando una metástasis ósea establecida se propaga a un sitio distante. Además, esta técnica también se desarrolló para producir un modelo de metástasis ósea que asegurara una mayor incidencia de injertos y crecimiento de tumores en hueso y en un sitio uniforme en comparación con las técnicas de inyección ortotópica o intravascular. Este modelo tiene claras ventajas sobre estas técnicas descritas. Este modelo implica la administración controlada y consistente de células tumorales en el hueso. También evita la metástasis pulmonar artifactual después de la embolización pulmonar y establece una población de estudio uniforme basal. Existe el beneficio de los tumores específicos del sitio con este modelo sin el riesgo de criterios de extirpación temprana resultantes de tumores primarios o metástasis a otros órganos. Por último, este modelo tiene una gran utilidad para la modificación, incluyendo el uso de xenoinjertos derivados de pacientes.
El modelo presentado tiene similitudes con la inyección directa de suspensión celular en el hueso siguiendo un enfoque quirúrgico seguido de inyección a través de la corteza o la administración en la cavidad medular después de hacer un pequeño defecto en la corteza (con o sin escariado de la cavidad medular)8,14,15,16,17 . Sin embargo, la implantación de un aloinjerto tumoral hace que esta técnica sea claramente diferente. Por lo tanto, el propósito de este informe fue demostrar este modelo de tumores óseos primarios y metástasis óseas de tumores sólidos, que supera muchas limitaciones de los modelos descritos anteriormente. Los grupos de investigación con experiencia en cultivo celular, modelos de ratón, anestesia y cirugía de ratón y anatomía de ratón están bien equipados para reproducir nuestra técnica para modelar tumores óseos primarios o metástasis óseas en ratones.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido.
1. Preparación de líneas celulares
- Cultivar líneas celulares de acuerdo con los protocolos estándar de cultivo celular del laboratorio para el cultivo celular tradicional o la inyección en ratones. Los protocolos estándar utilizados aquí son el crecimiento en el medio de Eagle modificado de Dulbecco que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), L-glutamina y penicilina / estreptomicina (en lo sucesivo conocido como medio de crecimiento completo).
NOTA: En este experimento, las células de osteosarcoma de Abrams se utilizan en ratones Balb/c Foxn1 nu/nu . Para los estudios de cáncer de mama, se utilizan células 4T1 en ratones Balb/c y células EO771 en ratones C57BL/6. - Cultivar células en frascos de cultivo de tejidos ventilados o en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos a 37 °C con un 5% deCO2.
- Pasar la línea celular de interés y preparar las células para la inyección cuando las células alcanzan una confluencia comúnmente utilizada con la inyección de estas células en ratones.
2. Animales
- Use ratones Balb/c Foxn1 nu/nu al menos de 6-8 semanas de edad para la generación de tumores subcutáneos para asegurarse de que los animales están más allá de la fase de crecimiento rápido y han alcanzado la edad adulta y la madurez esquelética.
- Use ratones machos o hembras. Haga excepciones al seleccionar líneas celulares sensibles a las hormonas (por ejemplo, células de cáncer de mama en ratones hembra y células de cáncer de próstata en ratones machos).
- Para experimentos de xenoinjertos, use ratones desnudos atímicos inmunodeficientes basados en que la línea celular es incompatible con un sistema inmune de ratón intacto en condiciones normales.
- Para experimentos de aloinjertos utilizando líneas celulares murinas, esto también se recomienda en función de diferentes antecedentes genéticos e inmunes de ratón. Sin embargo, para experimentos singénicos, use animales de la misma cepa que la línea celular de interés.
- Animales domésticos en densidades estándar dependiendo de las políticas de cría de la institución.
3. Tumores subcutáneos
- Cosechar líneas celulares de cultivo mediante tripsinización y resuspender en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
- Evaluar la viabilidad celular y determinar la densidad celular mediante el método de exclusión de azul de tripano. Use un hemocitómetro o un contador celular automatizado para contar las células. Se debe utilizar una viabilidad celular mínima del 90% para inyección en ratones para crear tumores subcutáneos.
- Ajuste la densidad celular para inyectar 1-2 x 105 células en un volumen final de 0.1 a 0.15 ml (100 a 150 μL) de PBS estéril. Mantenga las células en hielo hasta la inyección.
- Alternativamente, las células de pellet por centrifugación a 800 x g durante 5 min. Desechar el sobrenadante y volver a suspender las células peletizadas en un medio de matriz de membrana basal estéril sin diluir para obtener 1-2 x 105 células en un volumen final de 0,1 a 0,15 ml (100 a 150 μL). Mantenga las células en hielo hasta que se sigan usando.
- Anestesiar ratones para ser utilizados para el crecimiento tumoral subcutáneo con isoflurano en anestesia con oxígeno. Utilizar una dosis de inducción de isoflurano al 5% en 2 L/min de oxígeno y una dosis de mantenimiento de 2-3% de isoflurano en 2 L/min de oxígeno. Compruebe la falta de reflejos de parpadeo o pedal antes de continuar.
NOTA: El isoflurano es un anestésico inhalatorio. Use isoflurano en un área bien ventilada con sistemas apropiados de recolección de gases libres y eliminación. Consulte con el personal veterinario institucional para desarrollar un plan para la inducción, mantenimiento y monitoreo de la anestesia, y asegúrese de que el personal del laboratorio tenga la capacitación adecuada en el monitoreo de la anestesia y el manejo de agentes anestésicos inhalantes. - Retire el vello de la región dorsal del tórax o el abdomen de ratones anestesiados con solución depilatoria o con un cortapelos eléctrico. Se prefiere la solución depilatoria para minimizar el trauma potencial en la piel. Omita este paso si usa ratones desnudos atímicos.
- Limpie el área preparada con un hisopo de etanol al 70% antes de la inyección de la suspensión celular.
- Use una jeringa de tuberculina de 1 ml con una aguja de 27 G para inyectar células por vía subcutánea sobre la región dorsal del tórax o el abdomen, para que no se vean afectadas por el movimiento de los omóplatos. Alternativamente, inyecte las células por vía subcutánea como una suspensión en la matriz extracelular disponible comercialmente.
NOTA: La inyección en la matriz extracelular disponible comercialmente limitará la migración de la suspensión celular en el espacio subcutáneo porque estas matrices se solidifican a temperatura ambiente. - Recuperar los ratones en una almohadilla térmica en jaulas individuales hasta que sea ambulatorio. Los ratones pueden ser colocados en sus jaulas normales con ropa de cama limpia y seca.
- Monitorear el tamaño del tumor subcutáneo que recubre el tórax dorsal o el abdomen con un calibrador y medir el peso corporal semanalmente para asegurar que los tumores subcutáneos no se ulceren o que los ratones cumplan con los criterios de extracción temprana establecidos por el comité de cuidado y uso de animales de las instituciones. Se recomienda un tamaño máximo del tumor de 15 mm en cualquier dimensión para reducir el riesgo de ulceración cutánea o necrosis tumoral central.
NOTA: Consulte las pautas locales para determinar el tamaño/volumen máximo permisible del tumor. - Eutanasia a ratones portadores de tumores subcutáneos después de tres a cuatro semanas por inhalación deCO2 seguida de luxación cervical. Siga las políticas aceptables de la institución para la eutanasia de ratón.
- Cosechar tumores subcutáneos mediante técnica quirúrgica aséptica. Esterilice la piel que recubre el tumor como antes con etanol al 70% después de la eliminación del vello (si corresponde). Incide a través de la piel que recubre el tumor con una hoja de bisturí # 15 (con o sin un mango de hoja de bisturí). Diseccionar bruscamente el tumor de los tejidos blandos adjuntos circundantes con un par de tijeras quirúrgicas estériles.
- Coloque el tumor en placas de cultivo de tejido de 6 pocillos que contengan un medio de crecimiento completo y pique en múltiples fragmentos pequeños de tamaño predeterminado (~ 0.6 mm x 0.6 mm x 0.6 mm – 0.25 mm 3 hasta 1 mm x 1 mm x 1 mm – 1 mm3) con una hoja de bisturí #15 (con o sin mango de hoja de bisturí).
- Mantener los fragmentos tumorales en medio de crecimiento completo estéril a temperatura ambiente hasta el momento de la implantación intratibial. Para las líneas celulares que portan luciferasa o genes reporteros fluorescentes, use imágenes bioluminiscentes o fluorescentes ex vivo para confirmar la viabilidad del tumor antes de la implantación intratibial en ratones.
- Para la criopreservación, coloque múltiples fragmentos en el mismo criovial en un medio de crecimiento completo suplementado con 20% de FBS y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Congelar gradualmente utilizando un sistema de criopreservación comercial a –80 °C y almacenar a largo plazo en nitrógeno líquido. Preservar los fragmentos tumorales para su posterior análisis, pero no para su futura implantación, mediante congelación rápida mediante inmersión en nitrógeno líquido. Almacene estos fragmentos tumorales congelados a largo plazo a –80 °C.
NOTA: Se ha informado previamente que los tumores congelados a presión no se injertan y crecen in vivo8.
4. Implantación quirúrgica de fragmentos tumorales subcutáneos
- Llevar los fragmentos frescos o criopreservados del tumor subcutáneo a temperatura ambiente en un medio de crecimiento completo antes de la implantación quirúrgica.
- Anestesiar ratones de la cepa de interés utilizando isoflurano en anestesia con oxígeno como se describe en la Sección 3. Compruebe la falta de reflejos del pedal antes de continuar. Administrar buprenorfina subcutánea a una dosis de 0,02-0,05 mg/kg para proporcionar analgesia perioperatoria. Esto se puede repetir cada 6-8 h en el período postoperatorio, si es necesario.
- Elimine el vello de la articulación de la rodilla derecha y la tibia proximal de la extremidad posterior con una solución depilatoria para minimizar el posible trauma en la piel.
- Frote el área preparada con antiséptico quirúrgico. Frote primero con un hisopo de etanol al 70% y luego frote con clorhexidina alterna y exfoliante salino.
- Visualice la tibia proximal como la región distal a la articulación de la rodilla mientras flexiona y extiende la articulación.
- Cree una incisión de 3-4 mm a nivel de la tibia proximal en la cara medial de la extremidad con una hoja de bisturí # 15 (con o sin mango de hoja de bisturí). Incisar a través de la piel y el tejido subcutáneo para exponer la corteza medial de la tibia proximal.
- Aplique una presión suave con la punta de una aguja de 25 G, mientras gira la punta, para crear un pequeño orificio en la corteza medial de la tibia proximal. Haga este orificio aproximadamente 2 mm distal a la articulación de la rodilla en un punto equidistante entre las cortezas tibiales craneal y caudal. Seleccione el tamaño de la aguja según el tamaño de los fragmentos del tumor.
- Use fórceps estériles para recoger e insertar los fragmentos tumorales en la cavidad medular de la tibia proximal. Use una aguja de 27 a 30 G para manipular el fragmento tumoral en el canal medular. Dependiendo del tamaño de los fragmentos del tumor, implante un mínimo de 0,5 mm3 de volumen tumoral total en cada tibia. Esto puede requerir la implantación de 1 o más fragmentos tumorales dependiendo del tamaño de los fragmentos tumorales creados.
NOTA: Las modificaciones para prevenir o limitar el desplazamiento del injerto fuera del hueso serían la colocación de cera ósea o cemento óseo en el defecto óseo o espuma de gel o un injerto de grasa subcutánea sobre el orificio en el hueso. - Coloque los bordes de la piel con adhesivo de tejido líquido estéril o una sola sutura de piel. No utilice clips para heridas en este sitio. Tenga cuidado si utiliza imágenes de fluorescencia en el período postoperatorio, ya que tanto los adhesivos tisulares como la sutura tienen el potencial de fluorescer.
- Recuperar los ratones en una almohadilla térmica en jaulas individuales hasta que sea ambulatorio.
5. Evaluación en serie y de punto final
- Anestesiar ratones usando isoflurano en anestesia con oxígeno como se describió anteriormente.
- Evaluar el crecimiento del tumor tibial de forma no invasiva mediante radiografía digital semanal, bioluminiscencia o imágenes de fluorescencia (si se utilizan células que expresan luciferasa o un gen reportero fluorescente). Las mediciones de calibre de la extremidad en el sitio de implantación también se pueden realizar en ratones despiertos.
- Además del monitoreo tradicional de ratones portadores de tumores (peso corporal, nivel de actividad, frecuencia respiratoria, aseo, postura, mentalidad y comportamiento), monitoree a los ratones semanalmente para detectar signos de cojera de las extremidades posteriores, hinchazón e infección del sitio quirúrgico.
- Controle la herida quirúrgica de la piel durante los primeros 10-14 días para detectar enrojecimiento excesivo, hinchazón, drenaje y dehiscencia de la herida hasta que la herida cutánea se cure. Después de 4-5 semanas, evalúe a los ratones de acuerdo con la evaluación de los resultados del estudio, ya sea vivos o después de la eutanasia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un resultado positivo se asociaría con el injerto tumoral y el crecimiento tumoral progresivo a lo largo del tiempo. Dependiendo del tipo de tumor, el crecimiento tumoral intraóseo puede estar asociado con cojera progresiva de las extremidades posteriores, pero muchos tumores no causan cojera a pesar de los signos de enfermedad ósea concomitante. El injerto exitoso se documentó con imágenes avanzadas, por lo que habría cambios radiográficos, μCT o μMRI progresivos en la tibia proximal asociados con el fenotipo óseo de la línea celular de interés (metástasis osteolítica, osteoblástica o mixta osteolítica/osteoblástica) (Figura 1)8. En nuestro informe anterior, el defecto cortical creado para la implantación del injerto tumoral fue visible en la tibia proximal 1 semana después de la implantación (Figura 1A). En la semana 2, hubo osteólisis visible y remodelación ósea adyacente al defecto cortical. De las semanas 2 a 5, hubo destrucción ósea progresiva y formación de hueso nuevo asociado con el injerto y crecimiento tumoral (Figura 1B-E). Para las líneas celulares con genes reporteros, los cambios óseos estarían acompañados por aumentos en las salidas de imágenes de fluorescencia o bioluminiscencia a lo largo del tiempo. La cojera aguda puede ser un indicador de fractura ósea patológica inminente o real, lo que requiere una evaluación radiográfica inmediata y cuidadosa del ratón, y posiblemente la eliminación temprana del estudio. Dependiendo de la línea celular tumoral que se esté estudiando, la destrucción ósea puede ocurrir rápidamente, mucho antes de la metástasis. Esto es de importancia específica en estudios que involucran tumores óseos primarios, ya que los ratones pueden tener que ser eliminados del estudio antes del desarrollo de metástasis clínicamente relevantes, es decir, en el pulmón. En estos casos, se recomienda la amputación quirúrgica del miembro portador del tumor para permitir el estudio de la enfermedad residual mínima y la metástasis posterior cuando se utilizan tumores óseos primarios, como hemos relatado anteriormente 4,8. Si bien la amputación completa de las extremidades posteriores en las personas no se realiza típicamente, este es el estándar de atención en medicina veterinaria, cuyas similitudes en las características clínicas y moleculares del osteosarcoma humano y canino están bien documentadas. La amputación de extremidades posteriores en ratones es, por lo tanto, relevante para muchas líneas celulares animales. Además, la amputación es un método de tratamiento viable en ratones, ya que los procedimientos de preservación de extremidades utilizados en personas no se pueden lograr en roedores pequeños como los ratones. En ratones portadores de tumores óseos primarios, la inapetencia, la pérdida progresiva de peso, la mala condición corporal general y la dificultad para respirar (aumento de la frecuencia o el esfuerzo) pueden indicar el desarrollo de metástasis tumorales en el pulmón y otros órganos. Se recomienda la confirmación por imágenes bioluminiscentes, μCT o μMRI para confirmar la metástasis, y los animales afectados deben ser sacrificados.
Se debe sospechar un resultado negativo, muy probablemente como resultado de la falta de injerto tumoral, si no hay evidencia de cambios progresivos (lesiones osteolíticas, osteoblásticas u osteolíticas mixtas/osteoblásticas, dependiendo de la línea celular que se esté estudiando) en la radiografía o el examen μCT de la tibia implantada. Para las líneas celulares portadoras de genes reporteros, la falta de un aumento en la señalización de fluorescencia o bioluminiscencia a lo largo del tiempo por imágenes ópticas también respaldaría la conclusión de que el tumor no ha podido injertar. La falta o el injerto deficiente podrían estar asociados con la infección del sitio quirúrgico. Sin embargo, esto exhibiría signos clínicos específicos como enrojecimiento, hinchazón o secreción más comúnmente en el período postoperatorio temprano (primeras 1-2 semanas después de la cirugía). Los animales también podrían ser febriles y mostrar una falta de actividad o una postura encorvada en el período postoperatorio temprano debido a la infección del sitio quirúrgico. La recolección y el mantenimiento de los aloinjertos en condiciones estériles durante la preparación y la preparación estéril adecuada de la extremidad, la técnica intraoperatoria estéril y el cierre completo de la herida minimizarán la probabilidad de una complicación quirúrgica postoperatoria de la herida que resulte en infección y fracaso del injerto tumoral.
En nuestro informe anterior8, al incluir tanto los estudios piloto como los definitivos informados, 16 de 16 ratones (100%) implantados con fragmentos de osteosarcoma progresaron a lesiones óseas osteolíticas y 14 de estos 16 ratones (88%) desarrollaron metástasis. Todas las metástasis fueron observadas en el pulmón y diagnosticadas por histología tan pronto como 3 semanas después de la implantación8. Los animales adicionales necropsiados a las 1 (n = 2) y 2 (n = 2) semanas después de la implantación no revelaron ninguna evidencia de metástasis pulmonar.
Figura 1: Radiografía seriada. Radiografía seriada (en orden) realizada semanalmente en (A) 1, (B) 2, (C) 3, (D) 4 y (E) 5 semanas después de la implantación intratibial de un aloinjerto tumoral subcutáneo utilizando una línea celular de tumor óseo primario (osteosarcoma). Con el tiempo, hubo destrucción ósea progresiva y la formación de hueso nuevo asociado con el injerto y crecimiento tumoral. Esta cifra ha sido modificada con permiso de ref8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este informe documenta nuestro modelo para crear tumores óseos primarios o metástasis óseas después de la implantación intratibial de un aloinjerto tumoral. Creemos que hay varios pasos críticos en este proceso. Se debe establecer un plano anestésico seguro tanto para la inyección subcutánea de la suspensión de células tumorales como para la colocación intratibial de los fragmentos tumorales resultantes. Debe haber una preparación estéril del sitio quirúrgico tanto para la extracción del aloinjerto subcutáneo como para la colocación intratibial del aloinjerto. Los fragmentos de aloinjertos tumorales deben crearse uniformemente para la posterior implantación intratibial. Se debe crear un defecto del tamaño adecuado en la tibia proximal para la implantación de fragmentos de tumor. La herida cutánea quirúrgica debe cerrarse completamente para reducir el riesgo de complicaciones postoperatorias de la herida. El último paso crítico es que si se usa matriz extracelular como parte de la suspensión de células tumorales para inyección subcutánea, se debe usar las instrucciones de manejo recomendadas por el fabricante para evitar la solidificación de la suspensión antes de la inyección. La preparación estéril adecuada de la extremidad, la técnica intraoperatoria estéril y el cierre completo de la herida minimizarán la probabilidad de una complicación quirúrgica postoperatoria de la herida.
Las características del tumor implantado y la técnica quirúrgica son fundamentales para obtener resultados exitosos y reproducibles para su incorporación a su población de estudio. Inicialmente, se debe verificar que el xenoinjerto/aloinjerto tumoral se implante directamente en la cavidad medular de la tibia, asegurándose de que el tejido tumoral esté completamente dentro del hueso. Las modificaciones para prevenir o limitar el desplazamiento del injerto fuera del hueso serían inicialmente la colocación de cera ósea o cemento óseo en el defecto óseo o espuma de gel o un injerto de grasa subcutánea sobre el orificio en el hueso. Una alternativa sería insertar el aloinjerto tumoral a través de un orificio en la cara lateral de la tibia proximal, creado debajo del músculo tibial craneal. La presencia del músculo tibial craneal serviría como una cubierta biológica sobre el defecto óseo, limitando el desplazamiento potencial del aloinjerto tumoral. Sin embargo, este es un enfoque quirúrgico más agresivo con el potencial de trauma neuromuscular en la cara lateral de la tibia proximal. Se debe tener cuidado para asegurarse de que los aloinjertos tumorales se crean para tener un tamaño uniforme antes de la implantación. Dicho esto, los aloinjertos tumorales no deben exceder 1 mm en ninguna dimensión, ya que los tamaños tumorales más grandes en cualquier sistema biológico tienen menos probabilidades de injertarse que los injertos más pequeños cuando no hay un suministro vascular directo e inmediato proporcionado al injerto en el momento de la implantación. Hemos informado resultados exitosos con un volumen tumoral final implantado de 0.5 mm 3, pero anticipamos que los volúmenes combinados de fragmentos tumorales de hasta 1 mm3 lograrán resultados exitosos. Sin embargo, no se ha determinado el volumen máximo de fragmentos tumorales implantables. En comparación con el tejido criopreservado, los xenoinjertos y aloinjertos tumorales frescos tienen más probabilidades de sobrevivir, aunque no se ha observado un problema con la práctica de utilizar aloinjertos tumorales cuidadosamente criopreservados. Los aloinjertos congelados a presión no deben implantarse. Además, la disección de la cápsula y la porción externa del tumor subcutáneo evitará cualquier contribución de esta capa del tumor, que es en gran parte fibrosa y vascular con un infiltrado inmune significativo en lugar de consistir principalmente en células tumorales propiamente dichas. Un método alternativo para crear aloinjertos tumorales a partir de la masa tumoral más grande directamente con una hoja de bisturí es mediante el uso de una pequeña aguja de biopsia que crea un "núcleo" tumoral cilíndrico que luego se puede cortar a una longitud predefinida antes de la implantación. El uso de una aguja de biopsia o un punzón de biopsia central puede ser beneficioso para crear fragmentos tumorales uniformes para la implantación, ya que después de que el proceso de biopsia haya creado dos dimensiones uniformes (ancho y profundidad), se pueden cortar a una longitud adecuada antes de la implantación. Si se utilizan genes reporteros como luciferasa o proteínas fluorescentes en las células tumorales implantadas, la evaluación de los fragmentos tumorales en el momento de la implantación o 1 semana después de la implantación indicará la contribución relativa de las células tumorales en los fragmentos tumorales implantados, así como la viabilidad.
Al igual que con cualquier procedimiento, existen limitaciones además de los beneficios informados de esta técnica. La metástasis es un proceso de varios pasos que requiere que una célula desde su ubicación primaria ejecute con éxito la invasión y la migración a través de la matriz extracelular, intravasen el suministro de sangre del tumor, sobrevivan en circulación hasta que llegue a su destino metastásico final, se extravasen en el órgano propio y luego permanezcan en un estado latente o proliferen para crear una lesión metastásica. y modificación de la arquitectura normal del tejido para convertirse en una metástasis clínicamente detectable18. Los modelos de metástasis ósea utilizados actualmente en ratones se basan en gran medida en la inyección ortotópica directa de células tumorales en el sitio normal del tumor primario, la inyección intravascular en el ventrículo izquierdo del corazón o periféricamente en las venas de la cola (venas caudales laterales o dorsales), o la inyección intraósea directa de la suspensión de células tumorales3. Sin embargo, informes recientes que intentan mejorar los modelos de metástasis ósea han recomendado la inyección en las arterias ilíaca, caudal o femoral 19,20,21. Todos estos métodos incorporan uno o más pasos dentro de la cascada metastásica ósea, excepto la inyección intraósea directa o, en nuestro caso, la implantación de un aloinjerto tumoral, que solo modela la modificación tisular final. Por lo tanto, esta es una limitación inherente de nuestra técnica. Una limitación adicional es que, como se describe actualmente, requiere propagar los aloinjertos en un huésped de ratón intermedio, lo que requiere el uso de ratones adicionales y da como resultado la implantación de un tumor que no es 100% células tumorales puras. El aloinjerto poseerá alguna contribución estromal proporcionada por los tumores que crecen en una ubicación subcutánea. Una alternativa potencial para minimizar esta contribución estromal subcutánea sería la inyección de células por vía subcutánea en un sustrato biológico como una matriz extracelular o andamio. Alternativamente, se podría realizar una inyección ortotópica en el sitio primario del tumor, seguida de la extirpación del tumor y la preparación del injerto.
El método descrito en este informe tiene ventajas clave en comparación con los métodos existentes para modelar tumores óseos primarios o metástasis óseas después de la inyección intraósea directa de células tumorales. Como se discutió, nosotros y otros hemos observado embolización directa de los pulmones y muerte inmediata ocasional después de la inyección intratibial de una suspensión celular 8,13. Esto resulta de una inyección presurizada de células tumorales en la cavidad de la médula, después de lo cual las células tumorales ingresan al suministro de sangre periférica a través de los sinusoides vasculares de la médula ósea y se transportan al pulmón por retorno venoso. Estos eventos son comparables mecánicamente a los observados con tromboembolismo pulmonar o venoso asociado con la colocación presurizada de implantes en la cavidad medular asociada con la artroplastia articular total en personas y animales. Nosotros y otros planteamos la hipótesis de que este fenómeno embólico en los pulmones puede ser específico de la línea celular (observaciones no publicadas). Sin embargo, se han descrito pasos muy detallados para limitar la creación de estas metástasis embólicas artifactuales12. Inicialmente, debe haber una tripsinización adecuada y la creación de una suspensión uniforme de una sola célula para inyección, que debe almacenarse en hielo para evitar la aglutinación celular. La aguja debe colocarse correctamente a través de la placa de crecimiento tibial proximal, después de lo cual se deben realizar pequeños volúmenes de inyección (~ 10 μL) e inyecciones sin resistencia en la cavidad de la médula. A pesar de esto, la entrega de células tumorales a los pulmones, y también a otros órganos, se puede observar fácilmente mediante imágenes de bioluminiscencia siguiendo técnicas de inyección intraósea e intravascular, lo que sugiere que es posible que las células que generan esta señal bioluminiscente en los pulmones y otros órganos puedan dar lugar a metástasis a distancia (observaciones no publicadas)3. Hemos encontrado que otro beneficio de esta técnica es que un solo tumor crece en un sitio óseo uniforme dentro de la población de estudio, reduciendo la variabilidad de animal a animal. Esto permite el establecimiento de una población de estudio uniforme y una comparación rápida entre los grupos de tratamiento. Esto contrasta con la metástasis ósea que se desarrolla después de la inyección ortotópica o intravascular, donde es posible que las células hagan metástasis a diferentes sitios esqueléticos y crezcan con diferentes cinéticas, lo que dificulta las comparaciones entre los grupos de estudio. El crecimiento tumoral en un sitio anatómico después de la implantación de nuestros aloinjertos tumorales también evita la posibilidad de que los ratones sean extirpados debido a metástasis a otros sistemas de órganos o carga tumoral primaria, como se puede ver con las técnicas de inyección intravascular y ortotópica. Además, hemos observado un injerto del 100% después de la implantación del aloinjerto tumoral, lo que apoya una población de estudio uniforme y evita el uso innecesario de ratones adicionales para lograr números de tamaño de muestra apropiados. Esto también supera la limitación de la inyección incompleta e inexacta después de la inyección percutánea de suspensiones de células tumorales en el hueso.
Esta técnica tiene un alto grado de versatilidad que ha dado lugar a modificaciones que se están utilizando actualmente en nuestra investigación y tiene el potencial de una gran utilidad para futuras aplicaciones. Inicialmente, mientras empleamos la tibia proximal como nuestro sitio de implantación intraósea, otros sitios comunes de tumores óseos primarios o metástasis óseas se pueden usar fácilmente, incluidos, entre otros, el fémur distal y el húmero proximal. Sin embargo, el enfoque quirúrgico para estos sitios, así como para áreas como la pelvis y la columna vertebral requieren un enfoque quirúrgico gradualmente más extenso en comparación con la tibia proximal. Además, sitios como la pelvis, la columna vertebral, el cráneo, el radio y el cúbito no se benefician con un stock óseo adecuado para la implantación del tumor. Para neoplasias malignas invasivas óseas, como con tumores orales, la colocación de los aloinjertos tumorales adyacentes al hueso o dentro de la orofaringe también puede recapitular la progresión de los tumores invasivos 3,22. Los experimentos in vitro e in vivo a menudo emplean técnicas de cocultivo o coinyección para determinar los efectos de diferentes tipos de células en un tipo de célula de interés. Por lo tanto, existe la posibilidad de inyección de dos o más tipos de células simultáneamente para crear los tumores subcutáneos, que luego se pueden implantar en el hueso utilizando esta técnica. Las células modificadas genéticamente se pueden usar solas o en combinación con otras células normales o modificadas genéticamente para crear los aloinjertos tumorales. Con el creciente interés en la medicina de precisión y la creación de modelos in vitro e in vivo de cáncer humano, el trasplante de xenoinjerto derivado del paciente en ratones está ganando popularidad. Recientemente, se ha descrito un modelo de metástasis ósea de cáncer de mama en el que xenoinjertos derivados de pacientes implantados ortotópicamente metastatizados a discos óseos humanos implantados por vía subcutánea en ratones desnudos23. A partir de esto, los xenoinjertos derivados del paciente podrían implantarse directamente en el hueso utilizando nuestro modelo, sin la necesidad de un huésped intermedio para la propagación subcutánea. Esto permitiría la evaluación rápida de la cinética tumoral y la capacidad de evaluar múltiples combinaciones de tratamiento potencialmente a partir de una sola biopsia de paciente, sin requerir una gran masa tumoral para la preparación del aloinjerto. El creciente uso de organoides en la investigación del cáncer también podría emplearse en nuestro modelo24. Esto requeriría la inyección con aguja o pipeta de estos agregados celulares a través del orificio en la corteza tibial. Por lo tanto, recomendamos el sellado del defecto cortical (como se discutió anteriormente) para limitar la posibilidad de migración de organoides fuera de la cavidad ósea y medular. Como hemos realizado, las células pueden ser marcadas y rastreadas por imágenes ópticas (bioluminiscencia o fluorescencia) o avanzadas (radiografía digital, μCT o μMRI) que permiten la evaluación del crecimiento tumoral a lo largo del tiempo. Esto también tiene el beneficio de minimizar el número de animales, ya que los mismos animales son fotografiados a lo largo del tiempo.
En resumen, este informe demuestra nuestra técnica de modelado de tumores óseos primarios y metástasis óseas utilizando la implantación de injerto de tumor sólido en el hueso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
El Dr. Hildreth fue financiado por el NIH bajo el número de premio K01OD026527. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH.
Acknowledgments
Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP al desarrollo de esta técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 scalpel blade | Henry Schein Ltd. | 75614 | None |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture |
| Abrams osteosarcoma cell line | Not applicable | Not applicable | None |
| Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) | VetEquip | 901805 | None |
| Animal weighing scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | None |
| BALB/c nude mouse (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8 weeks of age. Male or female mice |
| Bone cement | Depuy Synthes | 160504 | Optional use instead of bone wax |
| Bone wax | Ethicon | W31G | Optional |
| Buprenorphine | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats |
| Carbon dioxide euthanasia station | N/A | N/A | Should be provided within animal facility |
| Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide | Heraeus | Various | None |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetoquinol | 411412 | None |
| Cryovials (2 ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| D-luciferin (Firefly), potassium salt | Perkin Elmer | 122799 | Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene |
| Digital caliper | Mitutoyo | 500-181-30 | Can be manual |
| Digital microradiography cabinet | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | Optional to evaluate bone response to tumor growth |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | None |
| Ethanol (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | None |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | None |
| Forceps, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | None |
| Freezer (– 80 °C) | Sanyo | MDF-794C | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | Can also use automated cell counter, if available |
| Hypodermic needles (27 gauge) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles |
| Ice | N/A | N/A | Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage |
| Iris scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Ltd. | 1182098 | None |
| IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system | Perkin Elmer | CLS136334 | Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes |
| L-glutamine | Thermofisher scientifc | 25030081 | None |
| Liquid nitrogen | British Oxygen Corporation | NA | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Liquid nitrogen dewar, 5 litres | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | Optional. Also available in 10 ml size (354230) |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes |
| Mr. Frosty freezing containiner | Fisher Scientific | 10110051 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | Can alternatively use an electric clipper with fine blade |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | None |
| Scalpel handle, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | User preference as long as it accepts #15 scalpel blade |
| Small animal heated pad | VetTech | HE006 | None |
| Stereomicroscope | GT Vision Ltd. | H600BV1 | None |
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine |
| Tissue adhesive (sterile) | 3M Corporation | 84-1469SB | Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size) |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | None |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | Use 0.05%-0.25% |
| Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) | Becton Dickinson | 309659 | Slip tip preferred over Luer |
| Vented tissue culture flasks, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | Can also use smaller or larger flasks, as needed |
References
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
- Simmons, J. K., et al.
- Wolfe, T. D., et al. Effect of zoledronic acid and amputation on bone invasion and lung metastasis of canine osteosarcoma in nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 28 (4), 377-389 (2011).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- James, J. J., et al. metastases from breast carcinoma: histopathological - radiological correlations and prognostic features. British Journal of Cancer. 89 (4), 660-665 (2003).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Chaffee, B. K., Allen, M. J. A clinically relevant mouse model of canine osteosarcoma with spontaneous metastasis. In Vivo. 27 (5), 599-603 (2013).
- Munajat, I., Zulmi, W., Norazman, M. Z., Wan Faisham, W. I. Tumour volume and lung metastasis in patients with osteosarcoma. Journal of Orthopaedic Surgery (Hong Kong). 16 (2), 182-185 (2008).
- Huang, X., et al. Risk and clinicopathological features of osteosarcoma metastasis to the lung: A population-based study. Journal of Bone Oncology. 16, 100230 (2019).
- Li, W., Zhang, S. Survival of patients with primary osteosarcoma and lung metastases. Journal of BUON. 23 (5), 1500-1504 (2018).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A.
- Maloney, C., et al. Intratibial Injection Causes Direct Pulmonary Seeding of Osteosarcoma Cells and Is Not a Spontaneous Model of Metastasis: A Mouse Osteosarcoma Model. Clinical Orthopedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
- Dai, J., Hensel, J., Wang, N., Kruithof-de Julio, M., Shiozawa, Y. Mouse models for studying prostate cancer bone metastasis. BoneKey Reports. 5, 777 (2016).
- Marques da Costa, M. E., et al. Establishment and characterization of in vivo orthotopic bioluminescent xenograft models from human osteosarcoma cell lines in Swiss nude and NSG mice. Cancer Medicine. 7 (3), 665-676 (2018).
- Raheem, O., et al. A novel patient-derived intra-femoral xenograft model of bone metastatic prostate cancer that recapitulates mixed osteolytic and osteoblastic lesions. Journal of Translational Medicine. 9, 185 (2011).
- Sasaki, H., Iyer, S. V., Sasaki, K., Tawfik, O. W., Iwakuma, T. An improved intrafemoral injection with minimized leakage as an orthotopic mouse model of osteosarcoma. Analytical Biochemistry. 486, 70-74 (2015).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Yu, C., et al. Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (115), e53982 (2016).
- Kuchimaru, T., et al. A reliable murine model of bone metastasis by injecting cancer cells through caudal arteries. Nature Communications. 9 (1), 2981 (2018).
- Haley, H. R., et al. Enhanced Bone Metastases in Skeletally Immature Mice. Tomography. 4 (2), 84-93 (2018).
- Lei, Z. G., Ren, X. H., Wang, S. S., Liang, X. H., Tang, Y. L. Immunocompromised and immunocompetent mouse models for head and neck squamous cell carcinoma. Onco Targets and Therapy. 9, 545-555 (2016).
- Lefley, D., et al. Development of clinically relevant in vivo metastasis models using human bone discs and breast cancer patient-derived xenografts. Breast Cancer Research. 21 (1), 130 (2019).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
