Summary
Knochenmetastasenmodelle entwickeln Metastasen nicht gleichmäßig oder mit einer 100%igen Inzidenz. Die direkte intraossäre Injektion von Tumorzellen kann zu einer Embolisation der Lunge führen. Wir stellen unsere Technik zur Modellierung von primären Knochentumoren und Knochenmetastasen mittels solider Tumortransplantatimplantation in den Knochen vor, was zu reproduzierbarem Transplantat und Wachstum führt.
Abstract
Primäre Knochentumoren oder Knochenmetastasen von soliden Tumoren führen zu schmerzhaften osteolytischen, osteoblastischen oder gemischten osteolytischen/osteoblastischen Läsionen. Diese Läsionen beeinträchtigen die Knochenstruktur, erhöhen das Risiko einer pathologischen Fraktur und lassen den Patienten nur begrenzte Behandlungsmöglichkeiten. Primäre Knochentumoren metastasieren in entfernte Organe, wobei sich einige Arten auf andere Skelettstellen ausbreiten können. Neuere Erkenntnisse deuten jedoch darauf hin, dass bei vielen soliden Tumoren Krebszellen, die sich in den Knochen ausgebreitet haben, die primäre Quelle für Zellen sein können, die schließlich in andere Organsysteme metastasieren. Die meisten syngenen oder Xenograft-Mausmodelle von primären Knochentumoren beinhalten eine intraossäre (orthotope) Injektion von Tumorzellsuspensionen. Einige Tiermodelle für Skelettmetastasen aus soliden Tumoren basieren ebenfalls auf einer direkten Knocheninjektion, während andere versuchen, zusätzliche Schritte der Knochenmetastaskade zu rekapitulieren, indem Zellen intravaskulär oder in das Organ des Primärtumors injiziert werden. Keines dieser Modelle entwickelt jedoch zuverlässig oder mit einer Inzidenz von 100% Knochenmetastasen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die direkte intraossäre Injektion von Tumorzellen mit einer möglichen Tumorembolisation der Lunge assoziiert ist. Diese embolischen Tumorzellen transplantieren die metastasierende Kaskade, rekapitulieren sie aber nicht. Wir berichteten über ein Mausmodell des Osteosarkoms, bei dem frische oder kryokonservierte Tumorfragmente (bestehend aus Tumorzellen plus Stroma) mit minimalinvasiver Operationstechnik direkt in die proximale Tibia implantiert werden. Diese Tiere entwickelten reproduzierbares Transplantat, Wachstum und im Laufe der Zeit Osteolyse und Lungenmetastasen. Diese Technik ist so vielseitig, dass sie zur Modellierung solider Tumorknochenmetastasen verwendet werden kann, und kann problemlos Transplantate verwenden, die aus einem oder mehreren Zelltypen, genetisch veränderten Zellen, von Patienten stammenden Xenotransplantaten und/oder markierten Zellen bestehen, die durch optische oder fortschrittliche Bildgebung verfolgt werden können. Hier demonstrieren wir diese Technik, indem wir primäre Knochentumore und Knochenmetastasen mit Hilfe der Implantation eines soliden Tumortransplantats in den Knochen modellieren.
Introduction
Mausmodelle für menschliche und tierische Krankheiten werden in der biomedizinischen Forschung immer beliebter. Der Nutzen der Verwendung von Mäusen in diesem Zusammenhang besteht darin, dass ihre Anatomie und Physiologie dem Menschen sehr ähnlich sind. Sie haben eine relativ kurze Tragzeit und Zeit im postnatalen Leben, um die Reife zu erreichen, und sind weitgehend mit relativ niedrigen Kosten und einfacher Unterbringung verbunden, obwohl steigende Entwicklungs- oder Anschaffungskosten mit einem höheren Grad an genetischer Veränderung, Immunschwäche und/oder Humanisierung verbunden sind1. Die Verwendung von Inzuchtstämmen führt zu einer weitgehend einheitlichen Tierpopulation vor dem Studieneinschluss. Eine vollständige Kenntnis ihres Genoms deutet auf ein hohes Maß an Ähnlichkeit mit dem Menschen hin. Orthologe molekulare Angriffspunkte für viele Krankheitsprozesse wurden im Genom der Maus identifiziert und es gibt nun eine umfangreiche Bibliothek mausspezifischer Reagenzien, die leicht erhältlich sind. Daher bieten sie die Möglichkeit, im Vergleich zu größeren Tiermodellen eine relativ schnelle und kostengünstigere Analyse mit relativ hohem Durchsatz durchzuführen1. Darüber hinaus stellen sie mit dem Aufkommen genetischer Editierungsstrategien, die die Überexpression oder Deletion bestimmter Gene entweder global oder zelltypspezifisch und/oder konstitutiv oder induzierbar ermöglichen, ein biologisch sehr nützliches Modellsystem für die Untersuchung menschlicher und tierischer Krankheitendar 2.
Krebs ist ein Bereich, in dem Mausmodelle von großem Nutzen sind. Genetische Mausmodelle für Krebs beruhen auf der Modulation der Expression von Onkogenen oder Tumorsuppressorgenen, allein oder in Kombination, damit Zellen eine onkogene Transformation durchlaufen können. Auch die Injektion von primären oder etablierten Tumorzelllinien in Mäuse wird durchgeführt. Die Einführung von Zelllinien oder Geweben von Menschen oder anderen Tierarten, einschließlich Mäusen, ist nach wie vor das am weitesten verbreitete Modell für Krebs in vivo. Die Verwendung von Zellen und Geweben unterschiedlicher Spezies (Xenotransplantate) bei immungeschwächten Mäusen wird am häufigsten durchgeführt2. Die Verwendung von Allotransplantat-Tumorzellen oder -geweben, bei denen sowohl der Wirt als auch der Empfänger derselben Spezies angehören, ermöglicht jedoch die Interaktion mit einem intakten Immunsystem, wenn sie mit demselben Wirtsmausstamm in syngenen Systemen kombiniert werden3.
Primäre Knochentumoren oder Knochenmetastasen von soliden Tumoren führen zu schmerzhaften osteolytischen, osteoblastischen oder gemischten osteolytischen/osteoblastischen Läsionen 3,4. Diese Tumore beeinträchtigen die Knochenstruktur, erhöhen das Risiko einer pathologischen Fraktur, und lassen den Patienten nur begrenzte Behandlungsmöglichkeiten. Primäre Knochentumoren metastasieren in entfernte Organe, wobei sich einige Arten auf andere Skelettstellen ausbreiten können. Bei Brustkrebspatientinnen ist der Knochen der häufigste Ort der ersten Metastasierung und der häufigste Ort des ersten Auftretens einer metastasierenden Erkrankung 5,6. Darüber hinaus sind disseminierte Tumorzellen (DTCs) im Knochenmark vor der Diagnose vorhanden und sagen die Entwicklung von Metastasen in anderen Organen voraus7. Daher wird angenommen, dass Krebszellen, die im Knochen vorhanden sind, die Quelle von Zellen sind, die schließlich in andere Organsysteme metastasieren. Es gibt viele Mausmodelle solider Tumormetastasen, die Metastasen vor allem in der Lunge und in den Lymphknoten und je nach Tumorart und Injektionstechnik möglicherweise auch in anderen Organsystemen entwickeln3. Es fehlen jedoch Mausmodelle für Knochenmetastasen, die zuverlässig und reproduzierbar ortsspezifische Skelettmetastasen erzeugen und Knochenmetastasen entwickeln, bevor Mäuse die Kriterien für eine frühzeitige Entfernung von der Primärtumorlast oder Metastasierung in andere Organe erreichen. Wir haben über ein Modell des primären Knochentumorosteosarkoms berichtet, das auf der chirurgischen Implantation eines soliden Tumorallotransplantats in die proximale Tibia von Mäusenberuht 8. Bei 100 % der Mäuse bildeten sich Knochentumore und bei 88 % der Mäuse entwickelten sich Lungenmetastasen. Diese Inzidenz von Metastasen übersteigt das, was üblicherweise klinisch bei Menschen berichtet wird (~20-50%), ist aber von großem Interesse, da die Lunge der häufigste Ort der Metastasierung bei Osteosarkomen ist 9,10,11. Während dieses Modell bei der Modellierung von primären Knochentumoren von Vorteil ist, hat es auch einen großen Nutzen bei der Modellierung von Knochenmetastasen aus anderen osteotropen soliden Tumoren wie Brust-, Lungen-, Prostata-, Schilddrüsen-, Leber-, Nieren- und Magen-Darm-Tumoren.
Der Grundgedanke für die Entwicklung dieses Modells war die Entwicklung einer Alternative zur traditionellen intraossären Injektion, typischerweise in die proximale Tibia oder den distalen Femur zur Modellierung von primären Knochentumoren oder Knochenmetastasen12. Unser primäres Ziel war es, eine bekannte Einschränkung dieser Technik, nämlich die Tumorembolisation der Lunge, zu lindern. Dies führt zur Transplantation dieser embolischen Tumorzellen und zu einer "künstlichen Metastasierung", die nicht die vollständige Metastaskade eines etablierten primären Knochentumors, der in die Lunge metastasiert, rekapituliert 8,13. Dies wäre auch der Fall, wenn sich eine etablierte Knochenmetastase auf eine entfernte Stelle ausbreitet. Darüber hinaus wurde diese Technik auch entwickelt, um ein Modell der Knochenmetastasierung zu erstellen, das im Vergleich zu orthotopen oder intravaskulären Injektionstechniken eine höhere Inzidenz von Transplantaten und Wachstum von Tumoren im Knochen und an einer einheitlichen Stelle gewährleisten würde. Dieses Modell hat deutliche Vorteile gegenüber diesen beschriebenen Techniken. Bei diesem Modell geht es um eine kontrollierte, konsistente Abgabe von Tumorzellen in den Knochen. Es vermeidet auch künstliche Lungenmetastasen nach Lungenembolisation und schafft eine einheitliche Studienpopulation zu Studienbeginn. Mit diesem Modell haben ortsspezifische Tumoren den Vorteil, dass keine vorzeitigen Entfernungskriterien durch Primärtumore oder Metastasen in andere Organe entstehen. Schließlich hat dieses Modell einen großen Nutzen für Modifikationen, einschließlich der Verwendung von Xenotransplantaten, die von Patienten stammen.
Das vorgestellte Modell weist Ähnlichkeiten mit der direkten Injektion einer Zellsuspension in den Knochen nach einem chirurgischen Ansatz auf, gefolgt von einer Injektion durch die Rinde oder einer Abgabe in die Knochenmarkhöhle nach einem kleinen Defekt in der Rinde (mit oder ohne Ausreiben der Markhöhle)8,14,15,16,17 . Durch die Implantation eines Tumor-Allotransplantats unterscheidet sich diese Technik jedoch deutlich. Daher war es das Ziel dieses Berichts, dieses Modell von primären Knochentumoren und Knochenmetastasen aus soliden Tumoren zu demonstrieren, das viele Einschränkungen der zuvor beschriebenen Modelle überwindet. Forschungsgruppen mit Erfahrung in Zellkultur, Mausmodellen, Mausanästhesie und -chirurgie sowie Mausanatomie sind gut gerüstet, um unsere Technik zur Modellierung von primären Knochentumoren oder Knochenmetastasen bei Mäusen zu reproduzieren.
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Protocol
Alle beschriebenen Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Cambridge, Cambridge, UK, genehmigt.
1. Herstellung von Zelllinien
- Züchten Sie Zelllinien in Übereinstimmung mit den Standard-Zellkulturprotokollen des Labors für herkömmliche Zellkulturen oder Injektionen in Mäuse. Die hier verwendeten Standardprotokolle sind das Wachstum in Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium, das 10 % fötales Kälberserum (FBS), L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin (im Folgenden als vollständiges Wachstumsmedium bezeichnet) enthält.
HINWEIS: In diesem Experiment werden Abrams-Osteosarkomzellen in Balb/c Foxn1 nu/nu-Mäusen verwendet. Für Brustkrebsstudien werden 4T1-Zellen in Balb/c-Mäusen und EO771-Zellen in C57BL/6-Mäusen verwendet. - Die Zellen werden entweder in belüfteten Gewebekulturflaschen oder in 6-Well-Gewebekulturplatten bei 37 °C in 5 % CO2 gezüchtet.
- Passieren Sie die interessierende Zelllinie und bereiten Sie die Zellen für die Injektion vor, wenn die Zellen eine Konfluenz erreichen, die üblicherweise bei der Injektion dieser Zellen in Mäuse verwendet wird.
2. Tiere
- Verwenden Sie Balb/c Foxn1 nu/nu-Mäuse im Alter von mindestens 6-8 Wochen für die subkutane Tumorbildung, um sicherzustellen, dass die Tiere die schnelle Wachstumsphase hinter sich gelassen haben und das Erwachsenenalter und die Skelettreife erreicht haben.
- Verwenden Sie entweder männliche oder weibliche Mäuse. Machen Sie Ausnahmen bei der Auswahl hormonempfindlicher Zelllinien (z. B. Brustkrebszellen bei weiblichen Mäusen und Prostatakrebszellen bei männlichen Mäusen).
- Verwenden Sie für Xenograft-Experimente immundefiziente athymische Nacktmäuse, die darauf basieren, dass die Zelllinie unter normalen Bedingungen mit einem intakten Immunsystem der Maus inkompatibel ist.
- Für Allotransplantat-Experimente mit murinen Zelllinien wird dies auch aufgrund unterschiedlicher genetischer und immuner Hintergründe der Maus empfohlen. Verwenden Sie jedoch für syngene Experimente Tiere desselben Stammes wie die gewünschte Zelllinie.
- Unterbringung von Tieren in Standarddichten, abhängig von den Haltungsrichtlinien der Einrichtung.
3. Subkutane Tumoren
- Entnahme von Zelllinien aus Kultur durch Trypsinisierung und Resuspendierung in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Beurteilen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen und bestimmen Sie die Zelldichte mit der Trypanblau-Ausschlussmethode. Verwenden Sie ein Hämozytometer oder einen automatischen Zellzähler, um die Zellen zu zählen. Eine Zellviabilität von mindestens 90 % soll für die Injektion in Mäuse verwendet werden, um subkutane Tumore zu erzeugen.
- Passen Sie die Zelldichte an, um 1-2 x 105 Zellen in einem Endvolumen von 0,1 bis 0,15 ml (100 bis 150 μl) sterilem PBS zu injizieren. Bewahren Sie die Zellen bis zur Injektion auf Eis auf.
- Alternativ können Pelletzellen durch Zentrifugieren bei 800 x g für 5 min zentrifugiert werden. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die pelletierten Zellen in unverdünntem sterilem Basalmembran-Matrixmedium, um 1-2 x 105 Zellen in einem Endvolumen von 0,1 bis 0,15 ml (100 bis 150 μl) zu erhalten. Bewahren Sie die Zellen bis zur weiteren Verwendung auf Eis auf.
- Anästhesieren Sie Mäuse für das subkutane Tumorwachstum mit Isofluran in der Sauerstoffanästhesie. Verwenden Sie eine Induktionsdosis von 5 % Isofluran in 2 l/min Sauerstoff und eine Erhaltungsdosis von 2-3 % Isofluran in 2 l/min Sauerstoff. Überprüfen Sie, ob keine Blinzel- oder Pedalreflexe vorhanden sind, bevor Sie fortfahren.
HINWEIS: Isofluran ist ein inhalatives Anästhetikum. Verwenden Sie Isofluran in einem gut belüfteten Bereich mit geeigneten Spül- und Freigassammelsystemen. Bitte wenden Sie sich an das Veterinärpersonal der Institution, um einen Plan für die Einleitung, Wartung und Überwachung der Anästhesie zu entwickeln, und stellen Sie sicher, dass das Laborpersonal über eine angemessene Ausbildung in der Anästhesieüberwachung und im Umgang mit Inhalationsanästhetika verfügt. - Entfernen Sie Haare aus dem dorsalen Bereich des Brustkorbs oder des Abdomens von anästhesierten Mäusen mit einer Enthaarungslösung oder mit einer elektrischen Haarschneidemaschine. Eine Enthaarungslösung wird bevorzugt, um ein mögliches Trauma der Haut zu minimieren. Überspringen Sie diesen Schritt, wenn Sie athymische Nacktmäuse verwenden.
- Reinigen Sie den vorbereiteten Bereich vor der Injektion der Zellsuspension mit einem Tupfer mit 70%igem Ethanol.
- Verwenden Sie eine 1-ml-Tuberkulinspritze mit einer 27-G-Nadel, um die Zellen subkutan über den dorsalen Bereich des Thorax oder des Abdomens zu injizieren, damit sie nicht durch Bewegungen der Schulterblätter beeinträchtigt werden. Alternativ können die Zellen subkutan als Suspension in handelsübliche extrazelluläre Matrix injiziert werden.
HINWEIS: Die Injektion in eine kommerziell erhältliche extrazelluläre Matrix begrenzt die Migration der Zellsuspension im subkutanen Raum, da diese Matrizen bei Raumtemperatur erstarren. - Bringen Sie die Mäuse auf einem Heizkissen in einzelnen Käfigen zurück, bis sie gehfähig sind. Die Mäuse können dann in ihre normalen Käfige mit sauberer, trockener Einstreu gesetzt werden.
- Überwachen Sie die Größe des subkutanen Tumors, der über dem dorsalen Thorax oder Abdomen liegt, mit einem Messschieber und messen Sie wöchentlich das Körpergewicht, um sicherzustellen, dass die subkutanen Tumore nicht ulzerieren oder Mäuse die Kriterien für eine frühzeitige Entfernung erfüllen, die vom Tierpflege- und -verwendungsausschuss der Institutionen festgelegt wurden. Eine maximale Tumorgröße von 15 mm in jeder Dimension wird empfohlen, um das Risiko von Hautulzerationen oder zentralen Tumornekrosen zu verringern.
HINWEIS: Konsultieren Sie die örtlichen Richtlinien, um die maximal zulässige Tumorgröße/das maximal zulässige Tumorvolumen zu bestimmen. - Euthanasieren Sie Mäuse mit subkutanen Tumoren nach drei bis vier Wochen durch CO2 - Inhalation mit anschließender Zervixluxation. Befolgen Sie die akzeptablen Richtlinien der Institution für die Euthanasie von Mäusen.
- Entnahme von subkutanen Tumoren mit aseptischer Operationstechnik. Sterilisieren Sie die Haut über dem Tumor wie zuvor mit 70%igem Ethanol nach Entfernung der Haare (falls zutreffend). Schnitt durch die Haut über dem Tumor mit einer #15 Skalpellklinge (mit oder ohne Skalpellklingengriff). Präparieren Sie den Tumor scharf von den umgebenden anhaftenden Weichteilen mit einer sterilen chirurgischen Schere.
- Platzieren Sie den Tumor in 6-Well-Gewebekulturplatten, die das vollständige Wachstumsmedium enthalten, und zerkleinern Sie ihn in mehrere kleine Fragmente vorbestimmter Größe (~ 0,6 mm x 0,6 mm x 0,6 mm – 0,25 mm, 3 bis 1 mm x 1 mm x 1 mm – 1 mm3) mit einer #15 Skalpellklinge (mit oder ohne Skalpellklingengriff).
- Bewahren Sie die Tumorfragmente bis zum Zeitpunkt der intratibialen Implantation in sterilem vollständigem Wachstumsmedium bei Raumtemperatur auf. Verwenden Sie für Zelllinien, die Luciferase- oder fluoreszierende Reportergene tragen, eine biolumineszente oder fluoreszierende Ex-vivo-Bildgebung, um die Lebensfähigkeit des Tumors vor der intratibialen Implantation in Mäuse zu bestätigen.
- Zur Kryokonservierung werden mehrere Fragmente in dasselbe Kryo in ein vollständiges Wachstumsmedium gegeben, das mit 20 % FBS und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) angereichert ist. Mit einer handelsüblichen Kryokonservierungsanlage bei –80 °C schrittweise einfrieren und langfristig in flüssigem Stickstoff lagern. Bewahren Sie Tumorfragmente für die spätere Analyse, aber nicht für eine zukünftige Implantation auf, indem Sie sie durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff einfrieren. Lagern Sie diese gefrorenen Tumorfragmente langfristig bei –80 °C.
HINWEIS: Es wurde bereits berichtet, dass schockgefrorene Tumore in vivonicht transplantieren und wachsen 8.
4. Chirurgische Implantation von subkutanen Tumorfragmenten
- Frische oder kryokonservierte Fragmente eines subkutanen Tumors werden vor der chirurgischen Implantation in einem vollständigen Nährmedium auf Raumtemperatur gebracht.
- Anästhesieren Sie Mäuse des interessierenden Stammes mit Isofluran in Sauerstoffanästhesie, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Überprüfen Sie, ob keine Pedalreflexe vorhanden sind, bevor Sie fortfahren. Verabreichen Sie subkutanes Buprenorphin in einer Dosis von 0,02-0,05 mg/kg zur perioperativen Analgesie. Dies kann bei Bedarf alle 6-8 Stunden in der postoperativen Phase wiederholt werden.
- Entfernen Sie die Haare am rechten Kniegelenk und am proximalen Schienbein der Hintergliedmaße mit einer Enthaarungslösung, um das mögliche Trauma der Haut zu minimieren.
- Schrubben Sie den vorbereiteten Bereich mit einem chirurgischen Antiseptikum. Schrubben Sie zuerst mit einem 70%igen Ethanoltupfer und schrubben Sie dann abwechselnd mit Chlorhexidin und Kochsalzlösung.
- Stellen Sie sich die proximale Tibia als die Region direkt distal des Kniegelenks vor, während Sie das Gelenk beugen und strecken.
- Erstellen Sie einen 3-4 mm großen Schnitt auf Höhe des proximalen Schienbeins auf der medialen Seite der Extremität mit einer #15 Skalpellklinge (mit oder ohne Skalpellklingengriff). Schnitt durch die Haut und das Unterhautgewebe, um den medialen Kortex der proximalen Tibia freizulegen.
- Üben Sie mit der Spitze einer 25-G-Nadel sanften Druck aus und drehen Sie die Spitze, um ein kleines Loch in der medialen Rinde der proximalen Tibia zu erzeugen. Machen Sie dieses Loch etwa 2 mm distal des Kniegelenks an einem Punkt, der zwischen der kranialen und kaudalen Tibiarinde gleich weit entfernt ist. Wählen Sie die Nadelstärke abhängig von der Größe der Tumorfragmente.
- Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Tumorfragmente aufzunehmen und in die Markhöhle der proximalen Tibia einzuführen. Mit einer 27 bis 30 G Nadel wird das Tumorfragment in den Markkanal manipuliert. Implantieren Sie je nach Größe der Tumorfragmente mindestens 0,5 mm3 Gesamttumorvolumen in jedes Schienbein. Dies kann die Implantation von 1 oder mehreren Tumorfragmenten erfordern, abhängig von der Größe der erzeugten Tumorfragmente.
Anmerkungen: Modifikationen, um eine Verschiebung des Transplantats außerhalb des Knochens zu verhindern oder zu begrenzen, wären das Platzieren von Knochenwachs oder Knochenzement in den Knochendefekt oder entweder Gelschaum oder ein subkutanes Fetttransplantat über dem Loch im Knochen. - Fixieren Sie die Hautränder mit sterilem Flüssiggewebekleber oder einer einzelnen Hautnaht. Verwenden Sie auf dieser Website keine Wundclips. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie in der postoperativen Phase eine Fluoreszenzbildgebung verwenden, da sowohl Gewebekleber als auch Nahtmaterial fluoreszieren können.
- Bringen Sie die Mäuse auf einem Heizkissen in einzelnen Käfigen zurück, bis sie gehfähig sind.
5. Serien- und Endpunktbewertung
- Anästhesieren Sie Mäuse mit Isofluran in der Sauerstoffanästhesie, wie zuvor beschrieben.
- Beurteilen Sie das Wachstum von Tibiatumoren nicht-invasiv entweder durch wöchentliche digitale Radiographie, Biolumineszenz oder Fluoreszenzbildgebung (bei Verwendung von Zellen, die Luciferase oder ein fluoreszierendes Reportergen exprimieren). Messschiebermessungen der Extremität an der Implantationsstelle können auch bei wachen Mäusen durchgeführt werden.
- Zusätzlich zur traditionellen Überwachung von tumortragenden Mäusen (Körpergewicht, Aktivitätsniveau, Atemfrequenz, Fellpflege, Körperhaltung, Mentation und Verhalten) werden Mäuse wöchentlich auf Anzeichen von Lahmheit, Schwellungen und Infektionen der Operationsstelle überwacht.
- Überwachen Sie die chirurgische Wunde in den ersten 10-14 Tagen auf übermäßige Rötungen, Schwellungen, Drainagen und Wunddehiszenz, bis die Hautwunde verheilt ist. Nach 4-5 Wochen sind die Mäuse in Übereinstimmung mit der Bewertung des Studienergebnisses entweder lebend oder nach Euthanasie zu bewerten.
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Representative Results
Ein positives Ergebnis wäre mit einer Tumortransplantation und einem fortschreitenden Tumorwachstum im Laufe der Zeit verbunden. Je nach Tumorart kann das intraossäre Tumorwachstum mit einer fortschreitenden Lahmheit der Hintergliedmaßen einhergehen, aber viele Tumoren verursachen trotz Anzeichen einer begleitenden Knochenerkrankung keine Lahmheit. Das erfolgreiche Engraftment wurde mit fortschrittlicher Bildgebung dokumentiert, wobei es zu progressiven röntgendialogischen, μCT- oder μMRT-Veränderungen in der proximalen Tibia kam, die mit dem Knochenphänotyp der interessierenden Zelllinie (osteolytische, osteoblastische oder gemischte osteolytische/osteoblastische Metastasen) assoziiert waren (Abbildung 1)8. In unserem vorherigen Bericht war der kortikale Defekt, der bei der Implantation eines Tumortransplantats entstanden war, 1 Woche nach der Implantation in der proximalen Tibia sichtbar (Abbildung 1A). In der 2. Woche kam es zu einer sichtbaren Osteolyse und einem Knochenumbau in der Nähe des kortikalen Defekts. Von der 2. bis 5. Woche kam es zu einer fortschreitenden Knochenzerstörung und der Bildung von neuem Knochen, die mit der Tumortransplantation und dem Tumorwachstum einherging (Abbildung 1B-E). Bei Zelllinien mit Reportergenen würden Knochenveränderungen im Laufe der Zeit mit einer Zunahme der Fluoreszenz- oder Biolumineszenz-Bildgebung einhergehen. Akute Lahmheit kann ein Indikator für einen bevorstehenden oder tatsächlichen pathologischen Knochenbruch sein, was eine sofortige und sorgfältige Röntgenuntersuchung der Maus und möglicherweise eine frühzeitige Entfernung aus der Studie erforderlich macht. Abhängig von der untersuchten Tumorzelllinie kann es schnell zu einer Knochenzerstörung kommen, lange vor der Metastasierung. Dies ist insbesondere bei Studien mit primären Knochentumoren von Bedeutung, da Mäuse vor der Entwicklung klinisch relevanter Metastasen, nämlich in die Lunge, aus der Studie entfernt werden müssen. In diesen Fällen wird eine chirurgische Amputation der tumortragenden Gliedmaße empfohlen, um die Untersuchung einer minimalen Resterkrankung und anschließender Metastasierung bei der Verwendung von primären Knochentumoren zu ermöglichen, wie wir bereits berichtet haben 4,8. Während eine vollständige Amputation der Hintergliedmaßen bei Menschen in der Regel nicht durchgeführt wird, ist dies Standard in der Veterinärmedizin, deren Ähnlichkeiten in den klinischen und molekularen Merkmalen des menschlichen und des caninen Osteosarkoms gut dokumentiert sind. Die Amputation der Hintergliedmaßen bei Mäusen ist daher für viele tierische Zelllinien relevant. Darüber hinaus ist die Amputation eine praktikable Behandlungsmethode bei Mäusen, da gliedmaßenerhaltende Verfahren, die beim Menschen angewendet werden, bei kleinen Nagetieren wie Mäusen nicht durchführbar sind. Bei Mäusen mit primären Knochentumoren können Inappetenz, fortschreitender Gewichtsverlust, allgemeiner schlechter Körperzustand und Atembeschwerden (erhöhte Frequenz oder Anstrengung) auf die Entwicklung von Tumormetastasen in der Lunge und anderen Organen hindeuten. Zur Bestätigung der Metastasierung wird eine Bestätigung durch Biolumineszenzbildgebung, μCT oder μMRT-Bildgebung empfohlen, und die betroffenen Tiere sollten eingeschläfert werden.
Ein negatives Ergebnis, das höchstwahrscheinlich auf das Fehlen einer Tumortransplantation zurückzuführen ist, sollte vermutet werden, wenn bei der Röntgen- oder μCT-Untersuchung der implantierten Tibia keine Hinweise auf progrediente Veränderungen (osteolytische, osteoblastische oder gemischte osteolytische/osteoblastische Läsionen, je nach untersuchter Zelllinie) vorliegen. Bei Zelllinien, die Reportergene tragen, würde das Fehlen einer Zunahme der Fluoreszenz- oder Biolumineszenzsignale im Laufe der Zeit durch optische Bildgebung auch die Schlussfolgerung stützen, dass der Tumor nicht transplantiert wurde. Ein fehlendes oder schlechtes Transplantat kann mit einer Infektion der Operationsstelle in Verbindung gebracht werden. Dies würde jedoch spezifische klinische Symptome wie Rötung, Schwellung oder Ausfluss am häufigsten in der frühen postoperativen Phase (erste 1-2 Wochen nach der Operation) aufweisen. Die Tiere können möglicherweise auch fieberhaft sein und in der frühen postoperativen Phase aufgrund einer Infektion an der Operationsstelle einen Mangel an Aktivität oder eine gekrümmte Haltung aufweisen. Die Entnahme und Pflege der Allotransplantate unter sterilen Bedingungen während der Präparation und die ordnungsgemäße sterile Vorbereitung der Extremität, die sterile intraoperative Technik und der vollständige Wundverschluss minimieren die Wahrscheinlichkeit einer postoperativen chirurgischen Wundkomplikation, die zu einer Infektion und einem Versagen der Tumortransplantation führt.
In unserem vorherigen Bericht8 entwickelten sich 16 von 16 Mäusen (100 %), denen Osteosarkomfragmente implantiert wurden, zu osteolytischen Knochenläsionen, und 14 dieser 16 Mäuse (88 %) entwickelten Metastasen. Alle Metastasen wurden in der Lunge beobachtet und histologisch bereits 3 Wochen nach der Implantation diagnostiziert8. Weitere Tiere, die 1 (n=2) und 2 (n=2) Wochen nach der Implantation nekropiert wurden, zeigten keine Hinweise auf Lungenmetastasen.
Abbildung 1: Serielle Radiographie. Serielle Röntgenaufnahmen (in der Reihenfolge) wöchentlich (A) 1, (B) 2, (C) 3, (D) 4 und (E) 5 Wochen nach intratibialer Implantation eines subkutanen Tumorallotransplantats unter Verwendung einer primären Knochentumorzelllinie (Osteosarkom). Im Laufe der Zeit kam es zu einer fortschreitenden Knochenzerstörung und der Bildung von neuem Knochen, die mit der Transplantation und dem Wachstum des Tumors verbunden war. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von ref8 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieser Bericht dokumentiert unser Modell zur Erzeugung von primären Knochentumoren oder Knochenmetastasen nach intratibialer Implantation eines Tumorallotransplantats. Wir glauben, dass es in diesem Prozess mehrere kritische Schritte gibt. Sowohl für die subkutane Injektion der Tumorzellsuspension als auch für die intratibiale Platzierung der resultierenden Tumorfragmente sollte eine sichere Anästhesieebene geschaffen werden. Die Operationsstelle sollte sowohl für die Entfernung des subkutanen Allotransplantats als auch für die intratibiale Platzierung des Allotransplantats steril vorbereitet werden. Tumorallotransplantatfragmente sollten für die anschließende intratibiale Implantation einheitlich angelegt werden. Für die Implantation von Tumorfragmenten sollte ein entsprechend großer Defekt in der proximalen Tibia angelegt werden. Die chirurgische Hautwunde sollte vollständig verschlossen werden, um das Risiko postoperativer Wundkomplikationen zu verringern. Der letzte kritische Schritt besteht darin, dass, wenn extrazelluläre Matrix als Teil der Tumorzellsuspension für die subkutane Injektion verwendet wird, die vom Hersteller empfohlenen Handhabungsanweisungen verwendet werden sollten, um eine Verfestigung der Suspension vor der Injektion zu vermeiden. Eine ordnungsgemäße sterile Präparation der Extremität, eine sterile intraoperative Technik und ein vollständiger Wundverschluss minimieren die Wahrscheinlichkeit einer postoperativen chirurgischen Wundkomplikation.
Die Merkmale des implantierten Tumors und der Operationstechnik sind entscheidend für erfolgreiche und reproduzierbare Ergebnisse für die Aufnahme in Ihre Studienpopulation. Zunächst sollte überprüft werden, ob das Tumor-Xenotransplantat/Allotransplantat direkt in die Markhöhle der Tibia implantiert wird, wobei sichergestellt wird, dass sich das Tumorgewebe vollständig im Knochen befindet. Modifikationen, um eine Verschiebung des Transplantats außerhalb des Knochens zu verhindern oder zu begrenzen, wären zunächst das Platzieren von Knochenwachs oder Knochenzement in den Knochendefekt oder entweder Gelschaum oder ein subkutanes Fetttransplantat über dem Loch im Knochen. Eine Alternative wäre, das Tumorallotransplantat durch ein Loch auf der lateralen Seite der proximalen Tibia einzuführen, das unter dem kranialen Tibiamuskel angelegt wird. Das Vorhandensein des kranialen Schienbeinmuskels würde dann als biologische Hülle über dem Knochendefekt dienen und eine mögliche Verschiebung des Tumorallotransplantats begrenzen. Dies ist jedoch ein aggressiverer chirurgischer Ansatz mit dem Potenzial für neuromuskuläre Traumata auf der lateralen Seite des proximalen Schienbeins. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Tumorallotransplantate vor der Implantation eine einheitliche Größe aufweisen. Davon abgesehen sollten Tumorallotransplantate in keiner Dimension mehr als 1 mm betragen, da größere Tumorgrößen in jedem biologischen System mit geringerer Wahrscheinlichkeit transplantiert werden als kleinere Transplantate, wenn das Transplantat zum Zeitpunkt der Implantation nicht direkt mit Gefäßen versorgt wird. Wir berichten über erfolgreiche Ergebnisse mit einem endgültigen implantierten Tumorvolumen von 0,5 mm3, gehen aber davon aus, dass kombinierte Tumorfragmentvolumina bis zu 1mm3 erfolgreiche Ergebnisse erzielen werden. Das maximale implantierbare Tumorfragmentvolumen wurde jedoch nicht bestimmt. Im Vergleich zu kryokonserviertem Gewebe haben frische Tumor-Xenotransplantate und Allotransplantate eine höhere Überlebenswahrscheinlichkeit, obwohl wir kein Problem mit der Praxis der Verwendung von sorgfältig kryokonservierten Tumorallotransplantaten beobachtet haben. Schnellgefrorene Allotransplantate sollten nicht implantiert werden. Darüber hinaus verhindert die Dissektion der Kapsel und des äußeren Teils des subkutanen Tumors jeglichen Beitrag dieser Schicht des Tumors, die weitgehend faserig und vaskulär mit einem signifikanten Immuninfiltrat ist, anstatt hauptsächlich aus eigentlichen Tumorzellen zu bestehen. Eine alternative Methode zur Herstellung von Tumorallotransplantaten aus der größeren Tumormasse direkt mit einer Skalpellklinge ist die Verwendung einer kleinen Biopsienadel, die einen zylindrischen Tumorkern erzeugt, der dann vor der Implantation auf eine vordefinierte Länge geschnitten werden kann. Die Verwendung einer Biopsienadel oder eines Stanzes für die Stanze kann bei der Herstellung einheitlicher Tumorfragmente für die Implantation von Vorteil sein, denn nachdem durch den Biopsieprozess zwei einheitliche Abmessungen (Breite und Tiefe) erzeugt wurden, können diese vor der Implantation auf eine geeignete Länge geschnitten werden. Wenn Reportergene wie Luciferase oder fluoreszierende Proteine in den implantierten Tumorzellen verwendet werden, zeigt die Auswertung der Tumorfragmente zum Zeitpunkt der Implantation oder 1 Woche nach der Implantation den relativen Beitrag der Tumorzellen zu den implantierten Tumorfragmenten sowie die Lebensfähigkeit.
Wie bei jedem Verfahren gibt es Einschränkungen zusätzlich zu den von uns berichteten Vorteilen dieser Technik. Metastasierung ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem eine Zelle von ihrem primären Standort aus erfolgreich in die extrazelluläre Matrix eindringen und durch sie wandern muss, die Blutversorgung des Tumors intravasieren, im Kreislauf überleben muss, bis er an seinem endgültigen metastasierenden Ziel ankommt, in das eigentliche Organ extravasiert und dann entweder in einem Ruhezustand verbleibt oder sich vermehrt, um eine metastasierende Läsion zu erzeugen. und Modifikation der normalen Gewebearchitektur zu einer klinisch nachweisbaren Metastase18. Gegenwärtig verwendete Mausmodelle für Knochenmetastasen beruhen weitgehend entweder auf der direkten orthotopen Injektion von Tumorzellen in das normale Gebiet des Primärtumors, der intravaskulären Injektion in die linke Herzkammer oder peripher in die Schwanzvenen (laterale oder dorsale Schwanzvenen) oder der direkten intraossären Injektion der Tumorzellsuspension3. Neuere Berichte, die versuchen, Knochenmetastasenmodelle zu verbessern, befürworten jedoch die Injektion in die illias, kaudale oder femoralen Arterien 19,20,21. Alle diese Methoden beinhalten einen oder mehrere Schritte innerhalb der Knochenmetastaskade, mit Ausnahme der direkten intraossären Injektion oder in unserem Fall der Implantation eines Tumorallotransplantats, das nur die Modifikation des Endgewebes modelliert. Daher ist dies eine inhärente Einschränkung unserer Technik. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass die Allotransplantate, wie derzeit beschrieben, in einem Zwischenwirt der Maus vermehrt werden müssen, was die Verwendung zusätzlicher Mäuse erfordert und zur Implantation eines Tumors führt, der nicht zu 100 % aus reinen Tumorzellen besteht. Das Allotransplantat besitzt einen gewissen stromalen Beitrag von Tumoren, die an einer subkutanen Stelle wachsen. Eine mögliche Alternative, um diesen subkutanen Stromabeitrag zu minimieren, wäre die subkutane Injektion von Zellen in ein biologisches Substrat wie eine extrazelluläre Matrix oder ein Gerüst. Alternativ kann eine orthotope Injektion in den primären Ort des Tumors, gefolgt von einer Tumorentfernung und Transplantatvorbereitung durchgeführt werden.
Die in diesem Bericht beschriebene Methode hat entscheidende Vorteile im Vergleich zu bestehenden Methoden zur Modellierung von primären Knochentumoren oder Knochenmetastasen nach direkter intraossärer Injektion von Tumorzellen. Wie bereits erwähnt, haben wir und andere eine direkte Embolisation der Lunge und gelegentlich einen sofortigen Tod nach intratibialer Injektion einer Zellsuspension beobachtet 8,13. Dies geschieht durch eine Druckinjektion von Tumorzellen in die Knochenmarkhöhle, woraufhin Tumorzellen über Knochenmark-Gefäßsinusoide in die periphere Blutversorgung gelangen und über einen venösen Rückfluss in die Lunge transportiert werden. Diese Ereignisse sind mechanistisch vergleichbar mit denen, die bei pulmonalen oder venösen Thromboembolien im Zusammenhang mit der druckbeaufschlagten Platzierung von Implantaten in die Knochenmarkhöhle im Zusammenhang mit einer totalen Gelenkendoprothetik bei Mensch und Tier beobachtet werden. Wir und andere vermuten, dass dieses embolische Phänomen in der Lunge zelllinienspezifisch sein könnte (unveröffentlichte Beobachtungen). Es wurde jedoch über sehr detaillierte Schritte berichtet, um die Entstehung dieser embolischen künstlichen Metastasen zu begrenzen12. Zunächst sollte eine ausreichende Trypsinisierung und die Bildung einer einheitlichen Einzelzellsuspension für die Injektion erfolgen, die auf Eis gelagert werden sollte, um eine Verklumpung der Zellen zu verhindern. Die Nadel sollte richtig durch die proximale tibiale Wachstumsfuge eingeführt werden, danach sollten kleine Injektionsvolumina (~10 μL) und widerstandsfreie Injektionen in die Knochenmarkhöhle durchgeführt werden. Trotzdem kann der Transport von Tumorzellen in die Lunge und auch in andere Organe durch Biolumineszenz-Bildgebung nach intraossären und intravaskulären Injektionstechniken leicht beobachtet werden, was darauf hindeutet, dass es möglich ist, dass Zellen, die dieses biolumineszente Signal in der Lunge und anderen Organen erzeugen, Fernmetastasen hervorrufen könnten (unveröffentlichte Beobachtungen)3. Wir haben herausgefunden, dass ein weiterer Vorteil dieser Technik darin besteht, dass ein einzelner Tumor in einer einheitlichen Knochenstelle innerhalb der Studienpopulation wächst, wodurch die Variabilität von Tier zu Tier verringert wird. Dies ermöglicht die Etablierung einer einheitlichen Studienpopulation und einen schnellen Vergleich zwischen den Behandlungsgruppen. Dies steht im Gegensatz zu Knochenmetastasen, die sich nach orthotoper oder intravaskulärer Injektion entwickeln, bei denen es möglich ist, dass Zellen an verschiedenen Skelettstellen metastasieren und mit unterschiedlicher Kinetik wachsen, was Vergleiche zwischen Studiengruppen schwierig macht. Das Tumorwachstum an einer anatomischen Stelle nach der Implantation unserer Tumorallotransplantate vermeidet auch die Möglichkeit, dass Mäuse aufgrund von Metastasen in andere Organsysteme oder Primärtumorbelastung entfernt werden, wie dies bei intravaskulären und orthotopen Injektionstechniken der Fall ist. Darüber hinaus haben wir ein 100%iges Engraftment nach Tumorallotransplantatimplantation beobachtet, was eine einheitliche Studienpopulation unterstützt und den unnötigen Einsatz zusätzlicher Mäuse vermeidet, um eine angemessene Stichprobengröße zu erreichen. Damit wird auch die Begrenzung der unvollständigen und ungenauen Injektion nach perkutaner Injektion von Tumorzellsuspensionen in den Knochen überwunden.
Diese Technik hat ein hohes Maß an Vielseitigkeit, was zu Modifikationen geführt hat, die derzeit in unserer Forschung verwendet werden und das Potenzial für einen großen Nutzen für zukünftige Anwendungen haben. Während wir zunächst die proximale Tibia als intraossäre Implantationsstelle verwenden, können auch andere häufige Stellen von primären Knochentumoren oder Knochenmetastasen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf den distalen Femur und den proximalen Humerus. Der chirurgische Zugang zu diesen Stellen sowie zu Bereichen wie Becken und Wirbelsäule erfordert jedoch einen allmählich umfangreicheren chirurgischen Ansatz im Vergleich zum proximalen Schienbein. Darüber hinaus profitieren Stellen wie das Becken, die Wirbelsäule, der Schädel, die Speiche und die Elle nicht von einem ausreichenden Knochenbestand für die Tumorimplantation. Bei knocheninvasiven Malignitäten, wie z. B. bei oralen Tumoren, kann die Platzierung der Tumorallotransplantate neben dem Knochen oder innerhalb des Oropharynx auch das Fortschreiten invasiver Tumoren rekapitulieren 3,22. In-vitro- und In-vivo-Experimente verwenden häufig Co-Kultur- oder Co-Injektionstechniken, um die Auswirkungen verschiedener Zelltypen auf einen Zelltyp von Interesse zu bestimmen. Daher besteht die Möglichkeit, zwei oder mehr Zelltypen gleichzeitig zu injizieren, um die subkutanen Tumore zu erzeugen, die dann mit dieser Technik in den Knochen implantiert werden können. Genetisch veränderte Zellen können allein oder in Kombination mit anderen normalen oder genetisch veränderten Zellen verwendet werden, um die Tumorallotransplantate herzustellen. Mit dem wachsenden Interesse an der Präzisionsmedizin und der Erstellung von In-vitro- und In-vivo-Modellen für menschlichen Krebs gewinnt die patienteneigene Xenotransplantattransplantation bei Mäusen an Popularität. Kürzlich wurde ein Modell der Knochenmetastasierung von Brustkrebs beschrieben, bei dem orthotopisch implantierte Xenotransplantate von Patienten in menschliche Knochenscheiben metastasierten, die subkutan in Nacktmäusen implantiert wurden23. Daraus könnten patienteneigene Xenotransplantate mit unserem Modell direkt in den Knochen implantiert werden, ohne dass ein Zwischenwirt für die subkutane Vermehrung erforderlich ist. Dies würde eine schnelle Bewertung der Tumorkinetik und die Möglichkeit ermöglichen, mehrere Behandlungskombinationen zu bewerten, die möglicherweise aus nur einer einzigen Patientenbiopsie bestehen, ohne dass eine große Tumormasse für die Allotransplantatpräparation erforderlich wäre. Der zunehmende Einsatz von Organoiden in der Krebsforschung könnte auch in unserem Modell24 zum Einsatz kommen. Dazu müssten diese Zellaggregate mit einer Nadel oder Pipette durch das Loch in der Tibiarinde injiziert werden. Wir empfehlen daher eine Versiegelung des kortikalen Defekts (wie oben beschrieben), um die Möglichkeit einer Organoidmigration außerhalb der Knochen- und Knochenmarkhöhle zu begrenzen. Wie wir durchgeführt haben, können Zellen durch optische (Biolumineszenz oder Fluoreszenz) oder fortschrittliche (digitale Radiographie, μCT oder μMRT) Bildgebung markiert und verfolgt werden, was die Beurteilung des Tumorwachstums im Laufe der Zeit ermöglicht. Dies hat auch den Vorteil, dass die Anzahl der Tiere minimiert wird, da dieselben Tiere im Laufe der Zeit abgebildet werden.
Zusammenfassend demonstriert dieser Bericht unsere Technik zur Modellierung von primären Knochentumoren und Knochenmetastasen mittels Implantation solider Tumortransplantate in den Knochen.
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Disclosures
Dr. Hildreth wurde von den NIH unter der Fördernummer K01OD026527 gefördert. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und spiegelt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der NIH wider.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen den entscheidenden Beitrag von Dr. Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP zur Entwicklung dieser Technik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 scalpel blade | Henry Schein Ltd. | 75614 | None |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture |
| Abrams osteosarcoma cell line | Not applicable | Not applicable | None |
| Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) | VetEquip | 901805 | None |
| Animal weighing scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | None |
| BALB/c nude mouse (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8 weeks of age. Male or female mice |
| Bone cement | Depuy Synthes | 160504 | Optional use instead of bone wax |
| Bone wax | Ethicon | W31G | Optional |
| Buprenorphine | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats |
| Carbon dioxide euthanasia station | N/A | N/A | Should be provided within animal facility |
| Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide | Heraeus | Various | None |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetoquinol | 411412 | None |
| Cryovials (2 ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| D-luciferin (Firefly), potassium salt | Perkin Elmer | 122799 | Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene |
| Digital caliper | Mitutoyo | 500-181-30 | Can be manual |
| Digital microradiography cabinet | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | Optional to evaluate bone response to tumor growth |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | None |
| Ethanol (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | None |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | None |
| Forceps, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | None |
| Freezer (– 80 °C) | Sanyo | MDF-794C | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | Can also use automated cell counter, if available |
| Hypodermic needles (27 gauge) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles |
| Ice | N/A | N/A | Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage |
| Iris scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Ltd. | 1182098 | None |
| IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system | Perkin Elmer | CLS136334 | Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes |
| L-glutamine | Thermofisher scientifc | 25030081 | None |
| Liquid nitrogen | British Oxygen Corporation | NA | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Liquid nitrogen dewar, 5 litres | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | Optional. Also available in 10 ml size (354230) |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes |
| Mr. Frosty freezing containiner | Fisher Scientific | 10110051 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | Can alternatively use an electric clipper with fine blade |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | None |
| Scalpel handle, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | User preference as long as it accepts #15 scalpel blade |
| Small animal heated pad | VetTech | HE006 | None |
| Stereomicroscope | GT Vision Ltd. | H600BV1 | None |
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine |
| Tissue adhesive (sterile) | 3M Corporation | 84-1469SB | Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size) |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | None |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | Use 0.05%-0.25% |
| Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) | Becton Dickinson | 309659 | Slip tip preferred over Luer |
| Vented tissue culture flasks, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | Can also use smaller or larger flasks, as needed |
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