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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Standardisierung eines zytometrischen Bead-Assays auf Basis von Eigelb-Antikörpern

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65123
Automatic Translation
1,2,3, 2,3,4, 1, 2, 2, 2,5, 2,3,5, 1,2,3,5
1Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas - UFAM, 2Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 4Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia – Universidade Estadual do Amazonas/Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, 5Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Herstellung von Latexkügelchen für Assays mit IgY-Antikörpern für den Antigennachweis.

Abstract

Immunoassays sind wichtige Tests für den Nachweis zahlreicher molekularer Ziele. Unter den derzeit verfügbaren Methoden hat der zytometrische Bead-Assay in den letzten Jahrzehnten an Bedeutung gewonnen. Jede Mikrosphäre, die vom Gerät gelesen wird, stellt ein Analyseereignis der Wechselwirkungskapazität zwischen den zu testenden Molekülen dar. Tausende dieser Ereignisse werden in einem einzigen Assay abgelesen, wodurch eine hohe Assaygenauigkeit und Reproduzierbarkeit gewährleistet wird. Diese Methodik kann auch bei der Validierung neuer Inputs, wie z. B. IgY-Antikörper, für die Diagnose von Krankheiten eingesetzt werden. Diese Antikörper werden gewonnen, indem Hühner mit dem interessierenden Antigen immunisiert und dann das Immunglobulin aus dem Eigelb der Tiere extrahiert wird. Daher ist dies eine schmerzfreie und hochproduktive Methode zur Gewinnung der Antikörper. Neben einer Methodik zur hochpräzisen Validierung der Antikörpererkennungskapazität dieses Assays wird in dieser Arbeit auch eine Methode zur Extraktion dieser Antikörper, zur Bestimmung der besten Kopplungsbedingungen für die Antikörper und Latexkügelchen und zur Bestimmung der Sensitivität des Tests vorgestellt.

Introduction

Unter den Immunoassay-Techniken zur Diagnose von Krankheiten hat sich der zytometrische Bead-Assay als hochempfindlicher und zuverlässiger Ansatz herausgestellt, da er die Analyse von Tausenden von Partikeln in einem einzigen Assay ermöglicht1. Diese Technik bietet nicht nur eine hohe Produktivität und die Verwendung kleinerer Probenvolumina, sondern auch eine große Flexibilität, da sie den Nachweis mehrerer Moleküle wie Zytokine, Adhäsionsmoleküle, Antikörperisotypen und Proteine ermöglicht 2,3.

Für die Entwicklung dieser Assays werden verschiedene Partikel verwendet, darunter Latexperlen, die ein effektiver und kostengünstiger Input sind. Diese können Modifikationen auf ihrer Oberfläche aufweisen, wie z. B. das Vorhandensein funktioneller Gruppen oder Proteine, die die kovalente oder nicht-kovalente Kopplung bestimmter Moleküle ermöglichen 3,4,5.

Diese Immunoassays verwenden Komponenten wie Antigene und Antikörper, um den Nachweis von Krankheitsmarkern durchzuführen, und erfordern in der Regel Antikörper von Säugetieren wie Mäusen, Kaninchen und Ziegen. Dies führt zu ethischen Problemen, da die Immunisierung von Säugetieren in der Regel viele Tiere erfordert, um einen guten Ertrag zu erzielen, sowie die häufige Durchführung von Verfahren, die zum Leiden der Tiere führen 6,7. Eine Alternative dazu ist die Verwendung von IgY-Antikörpern, die aus dem Eigelb immunisierter Hühner isoliert wurden, da im Eigelb hohe Konzentrationen der spezifischen Antikörper gegen die inokulierten Antigene zu finden sind; Die Produktion eines Huhns entspricht der Produktion von 4,3 Kaninchen im Laufe eines Jahres 6,7.

Daher ist es das Ziel dieses Protokolls, eine Methode zur Bewertung von IgY-Antikörpern bereitzustellen, die aus Hühnereigelb mittels Durchflusszytometrie mit Latexkügelchen gewonnen wurden. Zu diesem Zweck schlagen wir eine Standardisierungsmethode für einen zytometrischen Bead-Immunoassay im Sandwich-Format unter Verwendung von Latex-Beads vor. Als Modell haben wir IgY-Antikörper verwendet, die gegen das histidinreiche Protein-II-Antigen Plasmodium falciparum (IgY-Pf HRP2) gerichtet sind. Wir beschreiben eine Methode zur Extraktion der Antikörper, diskutieren die kritischen Schritte zur Bestimmung der Kopplungskonzentration dieser Antikörper an die Latexkügelchen und präsentieren eine Bewertung der Nachweisgrenze des Antigens. Die hohe Genauigkeit der Durchflusszytometrie, gepaart mit den niedrigen Kosten von Latexkügelchen, machen diese Technik für die Analyse von Immunoassay-Werkzeugen wie Antikörpern und Antigenen anwendbar. Diese Methode kann für die Detektion verschiedener Ziele verwendet werden.

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Protocol

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Extraktion von IgY aus Eigelb

  1. Hygienisierung der Eier
    1. Tauchen Sie die Eier (frisch gelegt oder bis 4 Tage nach der Lege, aus der Linie Gallus gallus Dekalb White) in eine 0,2%ige verdünnte Lösung von Natriumhypochlorit, spülen Sie sie schnell unter fließendem Wasser ab und wischen Sie sie für eine spätere oder sofortige Verwendung vorsichtig ab.
      HINWEIS: Bei nicht sofortiger Anwendung bis zu 15 Tage bei 4 °C aufbewahren.
  2. Trennung des Eigelbs
    1. Das Ei vorsichtig aufschlagen und das Eigelb mit Hilfe eines Dotterseparators vom Eiweiß trennen.
    2. Entfernen Sie das überschüssige Weiß mit Hilfe von Filterpapier. Stechen Sie das Eigelb ein und sammeln Sie sein Inneres in einem konischen 50-ml-Röhrchen. Lagern Sie das Eigelb vor Gebrauch mindestens 24 Stunden bei −20 °C.
      ANMERKUNG: Während dieser Experimente (Daten nicht gezeigt) wurde beobachtet, dass die Verwendung von Eigelb, das zuvor nicht eingefroren worden war, die Isolierung von Immunglobulinen aus dem Lipidanteil des Eigelbs behinderte.
  3. Ansäuerung des Eigelbs
    1. Tauen Sie das gelagerte Eigelb auf und verdünnen Sie es im Verhältnis 1:10 in 1 mM PBS. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit 1 N HCl auf 5 ein und inkubieren Sie die Lösung bei 4 °C für 6-24 Stunden.
    2. Die Lösung wird 40 min lang bei 3.000 × g zentrifugiert, der Überstand zurückgewonnen und mit einem 0,7-mm-Zellulosefilter filtriert.
  4. Ausfällung von Lipiden mit Caprylsäure
    1. Man stellt den pH-Wert der Überstände wieder auf 5 ein und gibt die Caprylsäure (≥98 % Anfangskonzentration) unter ständigem Rühren 30 min bei 4 °C auf eine Endkonzentration von 8,7 %.
      ANMERKUNG: Das Volumen des Überstandes kann in Abhängigkeit von der in Schritt 1.3.2 ausgefällten Lipidmasse variieren. So sollten beispielsweise 3,107 ml Caprylsäure zu 35 ml des nach der Filtration erhaltenen Überstandes gegeben werden.
    2. Die Proben werden 15 min lang bei 18.600 × g zentrifugiert und der Überstand vom gefällten Material getrennt.
    3. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit 1 M NaOH auf 7,4 um, quantifizieren Sie die Antikörper mit dem Bradford-Assay8 und lagern Sie die Antikörper bis zum Zeitpunkt der Anwendung bei −20 °C.
      HINWEIS: Die Antikörper wurden in einer Konzentration von 1 μg/μl erhalten, die mit einem 12%igen SDS-PAGE-Gel verifiziert wurde.

2. Sättigungskurve von IgY-Antikörpern gegen Latexkügelchen

  1. Kopplung der Beads an die IgY-Antikörper
    1. 21 μl 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC, Anfangskonzentration von 367 mM) und 21 μl N-Hydroxysuccinimid (NHS, Anfangskonzentration von 50 mM) zu 21 μl Latexkügelchen (4 % w/v) zugeben und mit gefiltertem 10 mM PBS auf ein Endvolumen von 2,1 ml einstellen.
      ANMERKUNG: Der pH-Bereich der PBS-Lösung sollte zwischen 7,2 und 7,4 liegen, da in dieser Arbeit eine negative Änderung der Kopplung und anderer Schritte beobachtet wurde, wenn eine Lösung außerhalb dieses Bereichs verwendet wurde.
    2. Bei 22 °C unter schnellem Schütteln 3 h inkubieren.
    3. Man gibt 4 μg, 2 μg, 1 μg, 0,5 μg, 0,25 μg, 0,125 μg und 0 μg des zuvor extrahierten Fängerantikörpers IgY-Pf HRP2 (siehe Schritt 1.4.3) zu verschiedenen Mikroröhrchen, die 100 μl der in Schritt 2.1.1 beschriebenen Lösung (0,04 % endgültige Kügelchenkonzentration) enthalten, und inkubiert unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 2.1.2 für 16 Stunden.
    4. Die Proben werden bei 857 × g bei 15 °C für 5 min zentrifugiert, die Überstände verworfen und die Latexkügelchen zweimal mit 500 μl gefiltertem 10 mM PBS (0,008 % Endkonzentration der Kügelchen) unter Verwendung von Zentrifugations- und Resuspensionszyklen gewaschen.
      ANMERKUNG: Überschreiten Sie nicht 857 × g, da in dieser Arbeit beobachtet wurde, dass die Perlen oberhalb dieser Geschwindigkeit Verformungen erfahren, die das Testergebnis negativ beeinflussen.
  2. Blockieren der Perlen
    1. Die Proben werden in 1 ml Blockierungspuffer (0,004 % endgültige Kügelchenkonzentration) (filtriert 10 mM PBS + Rinderserumalbumin, BSA, 5 %) resuspendiert und 2 h lang unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 2.1.2 beschrieben inkubiert.
    2. Nach dem Blockieren wie in Schritt 2.1.4 beschrieben waschen und in 10 mM PBS-Puffer resuspendieren.
  3. Inkubation mit Anti-Hühner-Sekundärantikörpern, markiert mit Alexa Fluor 488
    1. Zu jedem Mikroröhrchen werden 100 μl fluoreszierender Anti-Hühner-Antikörper (2 mg/ml), verdünnt auf 1:2.000 in 10 mM PBS + 0,5 % BSA, in jedes Mikroröhrchen gegeben, wie in Schritt 2.1.3 beschrieben.
    2. Die Proben werden wie in Schritt 2.1.2 beschrieben 30 Minuten lang im Dunkeln inkubiert.
    3. Die Kügelchen werden wie in Schritt 2.1.4 gewaschen und mit 250 μl (0,016 % Endkonzentration der Kügelchen) gefilterten 10 mM PBS resuspendiert. Führen Sie die Durchflusszytometerablesung wie in Abschnitt 5 beschrieben durch.
      HINWEIS: Anhand der erhaltenen Fluoreszenzprozentdaten ist der Anfangspunkt der Plateaubildung zu beobachten (1 μg, wie in dieser Studie beobachtet). Wir empfehlen, den zweiten Punkt des Plateaus (2 μg, wie hier beobachtet) für die nächsten Schritte zu verwenden (Abbildung 1).

Figure 1
Abbildung 1: Grafik der Durchflusszytometrie-Analyse zur Bestimmung des Sättigungspunktes der IgY-Pf HRP2 Antikörper-Kopplung an die Latexkügelchen. Die x-Achse stellt die Antikörperkonzentration dar, und die Y-Achse stellt die prozentuale Fluoreszenz dar. Kruskal-Wallis-Test, S. < 0,0033. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Durchflusszytometrie-Assay auf Basis von Latexkügelchen zum Antigennachweis

  1. Nachdem Sie den Sättigungspunkt der IgY-Antikörper gegen die Latexkügelchen bestimmt haben, führen Sie den Bead-Aktivierungsprozess gemäß Schritt 2.1.1 erneut durch.
    1. Die Kügelchen werden bei der beobachteten Sättigungskonzentration (wie in Schritt 2.1.3 beschrieben) gekoppelt und gemäß Schritt 2.1.2 inkubiert.
      HINWEIS: In den Assays, die mit dem IgY-PfHRP2-Antikörper durchgeführt wurden, betrug die Sättigungsbedingung 2 μg pro 1 μl Latexkügelchen.
  2. Blockieren und waschen Sie die Perlen gemäß Schritt 2.2.
  3. Inkubation mit dem Antigen
    1. Um die Nachweisgrenze zu bestimmen, wird das Äquivalent von 100 μl der blockierten Kügelchenzubereitung in Röhrchen verteilt, die unterschiedliche Mengen des rekombinanten Proteins Pf HRP2 (1 μg/ml) (rPfHRP2, 10 μg, 1 μg, 0,1 μg, 0,01 μg, 0,001 μg, 0,0001 μg und 0 μg) enthalten, verdünnt in 10 mM PBS + 0,5% BSA in dreifacher Ausführung.
      HINWEIS: Dieses rekombinante Protein wurde in der Arbeit von Sousa et al.9 entwickelt.
    2. Die Kügelchenlösungen werden mit dem Protein rPfHRP2 wie in Schritt 2.1.2 beschrieben für 1 h inkubiert.
    3. Führen Sie Waschvorgänge wie in Schritt 2.1.4 beschrieben durch und entsorgen Sie den Überstand nach der Zentrifugation.
  4. Inkubation mit dem Primärantikörper
    1. 2 μg Maus-IgG-Antikörper gegen das Protein rPfHRP2, verdünnt in 10 mM PBS + 0,5 % BSA, zu einem Endvolumen von 100 μl in jeder Probe zugeben. Die Proben werden wie in Schritt 2.1.2 beschrieben inkubiert und der Überstand nach der letzten Zentrifugation verworfen.
      HINWEIS: Dieser Antikörper wurde in der Arbeit von Sousa et al.9 entwickelt.
  5. Inkubation mit dem Sekundärantikörper
    1. Zu jeder Probe werden 100 μl fluoreszierender Anti-Maus-Antikörper (2 mg/ml), verdünnt auf 1:2.000 in 10 mM PBS + 0,5 % BSA, gegeben. Es wird wie in Schritt 2.1.2 beschrieben inkubiert und in 250 μl (0,016 % endgültige Kügelchenkonzentration) filtriertem 10 mM PBS resuspendiert. Führen Sie die Ablesung gemäß Abschnitt 5 durch.

4. Durchflusszytometerablesung der Proben

  1. Zytometrie-Einstellung: Ausrichtung der optischen Parameter des an einen Computer gekoppelten Zytometers
    1. Schalten Sie den Computer und das Durchflusszytometer ein und warten Sie einige Minuten, bis das Gerät eine Verbindung zum Computer hergestellt hat.
    2. Klicken Sie auf die auf dem Computer installierte Zytometrie-Software und melden Sie sich an. Wählen Sie im Arbeitsbereich der Software die Option Zytometer | Inbetriebnahme | Sauberer Modus | SIT-Flüssigkeiten.
      HINWEIS: Luftblasen und Verstopfungen sollten während des Zytometer-Initiierungsprozesses vor der Probenentnahme entfernt werden.
  2. Qualitätskontrolle
    1. Verwenden Sie das Reagenz zur Qualitätskontrolle, um die Spannungen der Photomultiplier-Röhrchen zu überprüfen und die Empfindlichkeit des Zytometers zu beurteilen.
    2. Platzieren Sie das Zytometer-Setup-Reagenz und die Tracking-Kügelchen in einem 12 mm x 75 mm großen Styroporröhrchen.
    3. Mischen Sie das Röhrchen vorsichtig durch Vortexen.
  3. Vorbereitung der Suspensionsperlen
    1. Um den Ausgangswert zu definieren, geben Sie 0,5 ml Verdünnungsmittel (10 mM gefiltertes PBS, pH 7) und drei Tropfen Kügelchen in das 12 mm x 75 mm große Styroporröhrchen. Den Schlauch vor Gebrauch vorsichtig abziehen.
    2. Wählen Sie im Arbeitsbereich der Zytometer-Software Zytometer | CST und warten Sie, bis das Zytometer von der Zytometer-Softwareschnittstelle getrennt und eine Verbindung zur CS&T-Schnittstelle hergestellt hat. Beachten Sie die folgende Meldung in der Statusleiste der Zytometer-Software am unteren Bildschirmrand: Zytometer getrennt.
    3. Verwenden Sie das 12 mm x 75 mm große Polystyrolröhrchen mit dem Reagenz für die Qualitätskontrolle und befestigen Sie es an der Durchflusszytometersonde.
  4. Verifizierung der Zytometerkonfiguration
    1. Überprüfen Sie im Fenster Systemübersicht , ob die Zytometerkonfiguration für das Experiment geeignet ist.
  5. Setup für eine Leistungsprüfung
    1. Wählen Sie die ID der Setup-Perlen aus, die der Charge der CS&T-Forschungsperlen entspricht.
  6. Leistungsprüfung
    1. Befestigen Sie das Röhrchen an der Durchflusszytometersonde und klicken Sie auf das Fenster Setup-Steuerung . Wählen Sie Leistung überprüfen und klicken Sie auf Ausführen.
    2. Sobald die Leistungsüberprüfung abgeschlossen ist, warten Sie, bis ein Dialogfeld geöffnet wird. Führen Sie einen der folgenden Schritte aus:
      1. Um den Zytometer-Leistungsbericht anzuzeigen, klicken Sie auf Bericht anzeigen.
      2. Um die Leistungsprüfung abzuschließen und zur Setup-Ansicht des Arbeitsbereichs zurückzukehren, klicken Sie auf Fertig stellen.
      3. Sehen Sie sich das Endergebnis der morphometrischen und Fluoreszenz-Sensitivitätsanalyse an, das in der Systemzusammenfassung | Zytometer-Leistungsergebnis mit dem Status PASSED.
      4. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Zytometer. Überprüfen Sie die Leistungsergebnisse des Zytometers, die im Fenster "Systemübersicht" angezeigt werden.

5. Probenanalyse mittels Durchflusszytometrie

  1. Melden Sie sich bei der Zytometer-Software an.
    1. Wählen Sie im Arbeitsbereich der Zytometer-Software die Option Zytometer | Sauberer Modus | SIT-Flüssigkeiten.
    2. Passen Sie sich an den Arbeitsbereich der Software an.
    3. Definieren Sie die Gating-Strategie basierend auf den morphometrischen und Fluoreszenzeigenschaften der Negativkontrollpartikel (Kügelchen ohne Fluoreszenz).
    4. Um die Zellmorphometrie zu bestimmen, wählen Sie Dot-Plot-Grafik für die Analyse der FSC-A-Parameter mit SSC-A (Ergänzende Abbildung 1A).
    5. Bestimmen Sie einzelne Zellen mit SSC unter Verwendung der Dot-Plot-Grafik für die Analyse von SSC-H auf der y-Achse und SSC-W auf der x-Achse (Ergänzende Abbildung 1B) und bestimmen Sie einzelne Zellen durch FSC mit der Dot-Plot-Grafik für die Analyse von FSC-H auf der y-Achse und FSC-W auf der x-Achse (Ergänzende Abbildung 1C).
    6. Für die Fluoreszenzanalysen wählen Sie FL1 Dot Plot Plots mit FCS-A. Verwenden Sie ein 12 mm x 75 mm großes Polystyrolröhrchen mit Stopfen und Proben mit unmarkierten Proben und Proben, die zuvor mit einfarbigem Alexa Fluor 488 gekennzeichnet wurden (ergänzende Abbildung 1D, E).
  2. Erfassen Sie die Probe in der Durchflusszytometrie.
    1. Verwenden Sie ein 12 mm x 75 mm großes Styroporröhrchen mit Stopfen, das die zuvor markierten Proben enthält. Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens sorgfältig, befestigen Sie das Röhrchen an der Durchflusszytometersonde und klicken Sie mit der linken Maustaste auf Erfassen.
    2. Um die Leistung der Laser einzustellen, klicken Sie auf Parameter und stellen Sie in den folgenden Optionen die Spannung des FSC auf 182 V und die Spannung des SSC auf 236 V ein. Um den Schwellenwert einzustellen, klicken Sie auf Zytometer | Schwellenwert und stellen Sie in den folgenden Optionen die Kolzov-Platte auf 500 V ein.
    3. Stellen Sie das Analysegatter ein, um Partikel nach Größe und Komplexität zu charakterisieren und Einzelzellanalysen durchzuführen.
    4. Um die Autofluoreszenz zu entfernen, analysieren Sie die farbstofffreie Probe, die nur die Latexkügelchen enthält, und passen Sie die Spannungen des Detektors an: Stellen Sie in den folgenden Optionen die Spannung des FL1 (FITC) auf 332 V ein.
    5. Stellen Sie das Fluoreszenzanalyse-Gate im viereckigen Format von dem negativen Punkt aus, der im Punktdiagramm angezeigt wird.
    6. Nachdem die morphometrischen und fluoreszierenden Analysen angepasst wurden, konfigurieren Sie das Gerät für 50.000 Ereignisse: Klicken Sie unter Erfassung auf Aufzeichnen.

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Representative Results

Abbildung 2 zeigt eine grafische Darstellung des Extraktionsprozesses von IgY-Antikörpern durch Ansäuerung und anschließende Trennung mit Caprylsäure (Abbildung 2).

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Extraktionsschritts von IgY-Antikörpern und der Trennung mittels Caprylsäure . (A) Abtrennung des Eigelbs, Rückgewinnung in einem konischen Röhrchen und Einfrieren. (B) Verdünnung des Eigelbs, Einstellung des pH-Werts auf 5. (C) Zentrifugation der Lösung und Filtration des Überstandes. (D) Zugabe von Caprylsäure und Zentrifugation der Lösung. (E) Überstehende Antikörper, die im vorherigen Schritt isoliert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

In dieser Arbeit zeigten die Antikörper vor (Spur 1, Abbildung 3) und nach der Caprylsäuretrennung (Spur 2, Abbildung 3) ähnliche elektrophoretische Profile mit charakteristischen Banden von 65 kDa bzw. 27 kDa, die sich auf die leichten bzw. schweren Ketten des IgY beziehen. Darüber hinaus waren auch andere Banden sichtbar, wahrscheinlich aufgrund des C-terminalen Fragments des Eigelbproteins Vitellogenin II-Vorläufer10.

Figure 3
Abbildung 3: SDS-PAGE (12% Gel) zur Demonstration des elektrophoretischen Profils des IgY-Pf HRP2-Antikörpers vor und nach der Trennung mit Caprylsäure. Spur M: molekularer Marker des Proteins; Spur 1: IgY-PfHRP2-Antikörper vor der Caprylsäure-Trennung; Spur 2: IgY-Antikörper nach Caprylsäure-Trennung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figur 4 ist eine schematische Darstellung des vorgeschlagenen Tests, einschließlich des ersten Schritts der Kopplung der IgY-Antikörper an die Latexkügelchen und der anderen Schritte zum Nachweis des Antigens und zum Ablesen in einem Durchflusszytometer.

Figure 4
Abbildung 4: Schematische Darstellung des zytometrischen Bead-Assays, der in der vorliegenden Studie vorgeschlagen wurde. (A) Inkubation von IgY-Pf-HRP2-Antikörpern mit Latexkügelchen. (B) IgY-Pf-HRP2-Antikörper, die an die Latexkügelchen gekoppelt sind. (C) Latexkügelchen, die an den IgY-Anti-Pf-HRP2-Protein gebunden sind, an den primären IgG-Antikörper gegen PfHRP2 der Maus und den fluoreszierenden sekundären Anti-Maus-Antikörpergekoppelt sind. (C1) Dot-Plot-Diagramm aus den Latexperlenproben, die mittels Durchflusszytometrie analysiert wurden. Die rosafarbene Linienbegrenzung stellt das Analysetor dar. (C2) Einzelzell-Analyse. (C3)Fluoreszenzanalyse einzelner Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Bewertung der Sättigungskonzentration der Antikörper in den Kügelchen ist ein entscheidender Schritt für die Entwicklung eines Immunoassays mit Latexkügelchen. Abbildung 1 zeigt eine Kurve der prozentualen Fluoreszenz verschiedener Konzentrationen von Antikörpern, die an jeden Mikroliter kommerzieller Latexkügelchen gekoppelt sind. Mit zunehmender Konzentration wurden steigende Prozentwerte beobachtet, und die Prozentwerte erreichten bei einer Antikörperkonzentration von 2 μg ein Plateau; Dies wurde dann als die beste Kopplungskonzentration für die Durchführung des Immunoassays mit dem Zielantigen angesehen. Dieser Assay zeigte vernachlässigbare Standardabweichungen zwischen den Replikaten (Supplemental Table S1).

Die Nachweisgrenze wurde durch die Auswertung des Fluoreszenzprozentsatzes der Reaktivität der Latexkügelchen (die den Anti-Pf HRP2-Antikörper in der sättigenden Konzentration enthalten) gegen verschiedene Konzentrationen des rPfHRP2-Proteins bestimmt (Abbildung 5). Nach der Entwicklung mit einem Sandwich-Immunoassay konnte ein Anstieg der Fluoreszenz ab einer Menge von 0,01 μg des rPfHRP2-Proteins beobachtet werden, und die prozentuale Fluoreszenz erreichte ein Plateau bei einer Menge von 0,1 μg. Beim Vergleich der Mengen von 0 μg und 0,01 μg gab es keinen signifikanten Unterschied in der Fluoreszenz zwischen ihnen. Beim Vergleich der Menge von 0,01 μg mit 0,1 μg, 1 μg und 10 μg wurde jedoch ein signifikanter Unterschied in der Fluoreszenz beobachtet: p < 0,0048 (Kruskal-Wallis-Test) (Abbildung 5). Auch dieser Test zeigte minimale Standardabweichungen zwischen den Replikaten (Ergänzungstabelle S2).

Figure 5
Abbildung 5: Diagramm der Durchflusszytometrie-Analyse zur Bestimmung der Nachweisgrenze des Proteins rPfHRP2 im vorgeschlagenen Sandwich-Assay. Die x-Achse stellt die Konzentration des Proteins rPfHRP2 dar, und die Y-Achse stellt die erhaltene prozentuale Fluoreszenz dar. Kruskal-Wallis-Test, S . < 0,0048. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung S1: Fluoreszenzanalyse des Eigelb-Antikörper-basierten Bead-Assays mittels Durchflusszytometrie. (A) Morphometrische Analyse der Größe nach Komplexität (FSC/SSC), (B) Analyse einzelner Zellen nach Komplexität, (C) Analyse einzelner Zellen nach Größe, (D,E) Analyse der prozentualen Fluoreszenz von Alexa Fluor 488 in Kugeln auf der Basis von Eigelb-Antikörpern in unterschiedlichen Konzentrationen. Abkürzungen: FSC = Vorwärtsstreuung; SSC = seitliche Streuung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungstabelle S1: Prozentuale Mittelwerte und Standardabweichungen des Sättigungskurventests der IgY-PfHRP2-Antikörperkopplung an die Latexkügelchen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungstabelle S2: Prozentuale Mittelwerte und Standardabweichungen der Nachweisgrenze des Proteins rPfHRP2. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Die Methode der Fällung des IgY-Antikörpers durch pH-Reduktion mit anschließender Lipidtrennung mit Caprylsäure ist effizient bei der Isolierung von Gesamtantikörpern ohne Funktionsverlust. Die hier vorgeschlagene Methode ist einfacher und billiger als die von Redwan et al.11 beschriebene, die ebenfalls eine Ausfällung durch Versauerung und Caprylsäure verwendeten, jedoch mit einem komplexeren und mühsameren Protokoll. Diese Methode bietet auch Vorteile gegenüber häufig verwendeten Methoden zur Isolierung von IgY aus Eigelb, wie z. B. solchen, die unter anderem PEG-Fällung 12,13, Natriumsulfat 14,15 und Chloroform 16 verwenden, da diese toxische Reagenzien oder Reagenzien enthalten, die schwer aus der Probe entfernt werden können. In dieser Arbeit waren die elektrophoretischen Profile der Antikörperproben, die vor und nach der Lipidtrennung mit Caprylsäure extrahiert wurden, ähnlich und wiesen das gleiche Profil auf. Nach der Trennung mit Caprylsäure wurden die Antikörper jedoch in einem Schritt konzentriert, der bei der Entfernung von Lipiden effizient war, ohne negative Auswirkungen auf die Entfernung kontaminierender Proteine aus den Proben zu haben.

Die Standardisierung der Methode zur Kopplung von IgY-Antikörpern an Latexkügelchen ist für die Maximierung der Analysekapazität der Durchflusszytometrie in jedem Assay unerlässlich. Bei den in unserem Labor durchgeführten Tests wurde beobachtet, dass Moleküle unterschiedlicher Größe je nach Anzahl der zu verwendenden Kügelchen unterschiedliche Sättigungskonzentrationen aufwiesen (Daten nicht gezeigt). Aus diesem Grund sollte für jeden durchzuführenden Assay idealerweise die Sättigungskonzentration der Kügelchen überprüft werden, wie in der vorliegenden Studie gezeigt. In dem hier beschriebenen Assay betrug die Sättigungskopplungsbedingung 2 μg IgY-Antikörper pro Mikroliter Kügelchen, da dies einen Fluoreszenzprozentsatz von nahezu 100 % aufwies und ein ähnlicher Prozentsatz bei einer Verdopplung der Antikörperkonzentration beibehalten wurde.

Der vorgeschlagene zytometrische Bead-Assay verwendet kommerzielle Latex-Beads, was die Verwendung von Zentrifugations- und Resuspensionszyklen für die Wasch- und Inkubationsschritte der Analysekomponenten impliziert. Die Waschungen sind ein entscheidender Schritt für den Erfolg des Tests, und daher ist es wichtig, keine größere Zentrifugationskraft als hier vorgeschlagen zu verwenden, da eine höhere Geschwindigkeit zu Veränderungen in der Morphologie der Kügelchen führt, was die Ablesung im Durchflusszytometer beeinträchtigt. Wenn die Zentrifugation jedoch weniger stark ist als die hier vorgeschlagene, besteht ein größeres Risiko des Verlusts von Kügelchen während des Prozesses, da sie leicht an den Wänden der Mikroröhrchen oder am Boden der Platten wieder aufgehängt werden können. Aus diesem Grund muss der Prozess der Entfernung des Überstandes sorgfältig durchgeführt werden, um diese Probleme zu vermeiden.

Bei der Anwendung dieser Methodik auf die Entwicklung von Immunoassays für andere Targets können Anpassungen in Bezug auf die Puffer, die Temperatur und die Inkubationszeit vorgenommen werden, wobei die spezifischen Eigenschaften der Antikörper und Antigene, die in dem neuen Test verwendet werden sollen, berücksichtigt werden. Die Analyse der Antigen-Sättigungskurve in der vorliegenden Studie ermöglichte die Bestimmung der Nachweisgrenze des Tests. Wie hier gezeigt, haben wir unter Verwendung der Konformation des Sandwich-Formats eine Nachweisgrenze von 0,01 μg identifiziert, und dieser Wert ähnelt der niedrigsten Nachweisgrenze, die mit konventionellem ELISA erhalten wurde. Dieser Test hat jedoch aufgrund der hohen Genauigkeit der in der Durchflusszytometrie durchgeführten Assays ein viel höheres Maß an Zuverlässigkeit als klassische ELISA-Methoden, wie die Nachweisgrenze aus mehreren früheren Studien wie Simonova et al.17 (5 pg/ml) zeigt. Sharma et al.19 zeigten eine 4-fach bis 80-fach höhere Sensitivität als herkömmlicher ELISA, und Merbah et al.19 erhielten einen Test, der 91% sensitiver war als konventioneller ELISA. Es kann auch beobachtet werden, dass diese CBA-Assays eine hohe Reproduzierbarkeit aufweisen, da die dreifachen Analysen in dieser Arbeit sehr geringe Standardabweichungen aufwiesen.

Die Haupteinschränkungen der hier beschriebenen Methode sind die Notwendigkeit eines Durchflusszytometers und die Tatsache, dass diese Methode aus mehreren Schritten besteht und einige Zeit in Anspruch nimmt. Die beschriebenen Schritte stellen eine wichtige Standardisierung dar, die notwendig ist, um die Zuverlässigkeit von diagnostischen Tests mit Latexkügelchen zu gewährleisten, die mittels Durchflusszytometrie ausgewertet werden. Daher ist die hier vorgeschlagene Methodik eine Alternative zu den klassischen Sandwich-Testmodellen. Diese Methode kann auf verschiedene Arten von Assays angewendet werden und eignet sich sowohl für die Kopplung mehrerer Moleküle an die Oberfläche der Kügelchen als auch für die Detektion verschiedener Analyten.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass keine potenziellen Interessenkonflikte in Bezug auf die Forschung, die Autorenschaft und die Veröffentlichung dieses Artikels bestehen.

Acknowledgments

Wir danken dem FIOCRUZ ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), dem Postgraduiertenprogramm in Biotechnologie (PPGBIOTEC an der Universidade Federal do Amazonas - UFAM), der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) und der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) für die Bereitstellung der Stipendien. Abbildung 2 und Abbildung 4 wurden mit biorender.com erstellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey Sigma-Aldrich SAB4600031
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 Sigma-Aldrich SAB4600388
BD FACSCanto II BD Biosciences BF-FACSC2
BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) BD Biosciences 655050
BD FACSDiva software 7.0 BD Biosciences 655677
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad #5000006
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Caprilic acid Sigma-Aldrich O3907
Centrifuge 5702 R Eppendorf Z606936
Chloride 37% acid molecular grade NEON 02618 NEON
CML latex, 4% w/v Invitrogen C37253
Megafuge 8R Thermo Scientific TS-HM8R
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) Sigma-Aldrich E7750-1G
N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 130672-25G
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich 1003335620
Sodium hydroxide Acs Cientifica P.10.0594.024.00.27
Sodium hypochlorite Acs Cientifica R09211000
Thermo Mixer Heat/Cool KASVI K80-120R

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References

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Biochemie Ausgabe 195 Durchflusszytometrie Antikörper IgY Latexperlen Diagnostik Immunoassays
Standardisierung eines zytometrischen Bead-Assays auf Basis von Eigelb-Antikörpern
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Corrêa Glória, J., Oliveira Chaves, Y., Marques de Figueiredo, A., Coutinho de Souza, C., Duarte da Silva, E. R., Lopes Batista, J. C., Nogueira, P. A., Morais Mariúba, L. A. Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies. J. Vis. Exp. (195), e65123, doi:10.3791/65123 (2023).

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