عزل CD 90+ الخلايا الليفية / Myofibroblasts من المجمدة الإنسان الجهاز الهضمي العينات
Summary
Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.
Abstract
الليفية / myofibroblasts (MFS) وقد تكتسب اهتماما متزايدا لدورها في التسبب ومساهماتها في كل من التئام الجروح وتعزيز المكروية الورم. في حين أن هناك حاليا عدة تقنيات لعزل MFS من الجهاز الهضمي (GI) الأنسجة، وهذا البروتوكول يدخل عنصرا جديدا من عزل هذه الخلايا اللحمية من الأنسجة المجمدة. تجميد عينات الأنسجة GI ليس فقط يسمح للباحث للحصول على عينات من المتعاونين في جميع أنحاء العالم، المصارف البيولوجية، والباعة التجارية، فإنه يسمح أيضا للتأخير في تجهيز عينات جديدة. سوف بروتوكول صفها تسفر باستمرار خلايا على شكل مغزل مميزة مع النمط الظاهري MF التي تعبر عن علامات CD90، α-SMA وvimentin. كما يتم الحصول على هذه الخلايا من عينات المرضى، واستخدام الخلايا الأولية أيضا يمنح صالح MFS محاكاة عن كثب من الدول، وهي أمراض السرطان وأمراض الأمعاء الالتهابية. هذا الأسلوب له النحلالتحقق من صحة ن في المعدة، الأمعاء الدقيقة، والقولون MF جيل ثقافة الأولية. ثقافات MF الأولية يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التجارب على مدى عدد من مرور ونقائها تقييم من قبل كل من مناعية وتحليل التدفق الخلوي.
Introduction
Myofibroblasts / الخلايا الليفية (MFS) تمثل السكان وفرة من الخلايا في الجهاز الهضمي (GI) الغشاء المخاطي. وتقع هذه الخلايا اللحمية فقط تحت ظهارة وتشكل شبكة مترابطة داخل الغشاء المخاطي الصفيحة المخصوصة في الأمعاء. MFS ليست مسؤولة فقط عن ترسب المصفوفة خارج الخلية، ولكن من خلال تنظيم نظير الصماوي قد تؤثر على النقل المنحل بالكهرباء، والرد، وظيفة حاجز ظهارة المجاورة 1 و 2. وعلاوة على ذلك، وقد ثبت MFS أن تلعب دورا رئيسيا في التهاب والأنسجة إعادة عرض 3 و 4. Myofibroblasts هي جزء هام من المكروية الورم، حيث من المعروف أيضا على أنها الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان، والمساهمة في نمو الخلايا السرطانية، ويكون بمثابة محراب للخلايا الجذعية السرطانية 3. وتشير البيانات الناشئة التي MFS أيضا أن تخدم خلايا مقدمة للمستضد المحلية. بالإضافة إلى ذلك، MFS ظيفة المنظمين هامة من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية، الم Ùالوراثة مجموعة متنوعة من السيتوكينات وعوامل النمو 5.
في الأشخاص الأصحاء، ويعتقد أن الخلايا MFS لتمييزها عن الخلايا الجذعية الوسيطة والتعبير على سطح الخلية، وعلامة الوسيطة، CD90 3، 5، وهذه الخلايا هي أيضا إيجابية للvimentin، ولكن سلبية لالظهارية والمكونة للدم علامة الخلية، EpCAM وCD45 ، على التوالي. واقترح Myofibroblasts أن يكون شكل تنشيط الخلايا الليفية ويمكن تمييزها عن الخلايا الليفية غير تفعيلها من خلال التعبير عن α-SMA 5.
على مدى العقد الماضي، مناهج متعددة لعزل myofibroblasts من الغشاء المخاطي للقولون الإنسان وقد نشرت معظمهم يعتمد على الطريقة الموصوفة في الأصل من قبل Mahida آخرون 5-8. في حين أفادت الدراسات الفردية إجراءات العزل من مختلف مخاطية الأمعاء، أي بروتوكول عالمي لعزل MFS من مناطق متعددة من الجهاز الهضمي (أي المعدة والصغيرة ولوقد نشرت مخاطية الأمعاء الدو). وقد تم اختبار البروتوكول المقدمة في هذه الوثيقة واستخدمت بنجاح لجميع أنواع ثلاثة من الأنسجة المذكورة أعلاه. . وعلاوة على ذلك، لم يتم الإبلاغ عن إجراءات لعزل MFS من الغشاء المخاطي GI المجمدة.
هنا، نقدم طريقة الأمثل، والتي تقوم على الهضم الأنزيمي، ويسمح في الوقت نفسه لعزل المخاطية أمعاء الإنسان MFS للثقافة والتدفق الخلوي التحليل في هضمها طازجة، خلية واحدة، والأعمال التحضيرية المخاطية. هذه التقنية تعطي موثوق الثقافات الأولية مع النمط الظاهري MF. وعلاوة على ذلك، نفس الأساليب يمكن أن تستخدم لعزل MFS من العينات المجمدة من الأنسجة المعوية المعدية والصغيرة أيضا. عزل myofibroblasts من الأنسجة GI جديدة وقد وصفت سابقا؛ ومع ذلك، فإن استخدام العينات المجمدة يقدم العديد من الفوائد. وهي، أن الباحثين سوف تكون قادرة على جمع وتخزين الأنسجة من أي عدد من المتعاونين في جميع أنحاء العالم الذين لديهم capabiعنه lity لشحن عينات الأنسجة المجمدة. وعلاوة على ذلك، قد يجد الباحثون مجموعة من الأنسجة التخلص من غرفة العمليات و / أو جناح التنظير وفورية معالجة الأنسجة لعزل الصراع مع الجدول الزمني التجريب وضعها الراهن. أيضا، نظرا لطبيعة لا يمكن التنبؤ بها من الجراحة، قد تحدث الشراء الأنسجة في وقت متأخر جدا من اليوم، والتي سوف تحد من الوقت المتبقي لالأنسجة المعالجة. سوف تجميد الأنسجة لمعالجة لاحق تحسين هذه التحديات.
وأخيرا، وقد استخدمت هذه الأساليب بنجاح في عزلة myofibroblasts المعوية القولون، المعدة والصغيرة في الحالات المرضية مثل سرطان القولون والمستقيم وامراض التهابات الامعاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين تم تطوير هذا البروتوكول لتطبيق الأبحاث فقط، في ضوء تزايد الأهمية الحاسمة للخلايا انسجة باعتباره المحتملة سرطان المؤشرات الحيوية النذير والهدف العلاجي، والقدرة على تجميد biospecimens "وظيفية" لاستخدامها لاحقا تقدم ميزة كبيرة. هذا يمثل ميزة فريدة من نوعها لخلق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).
Materials
| MEM, 1X | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
- Yamaguchi, H. et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485 (2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., & Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., & Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., & Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I. et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R. et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-1348 (1997).
- Roncoroni, L. et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7, 40 (2009).
- Pinchuk, I. V. et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori. Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798 (2013).
- Pinchuk, I. V. et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., & Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., & Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G. et al.Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., & Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215. (2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., & Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611. (2013).
- Schiller, J. H., & Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., & De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., & Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., & Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656 (2014).
