İnsan Frozen Gastrointestinal örneklerden CD 90+ fibroblast / miyofibroblastlar İzolasyonu
Summary
Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.
Abstract
Fibroblastlar / miyofibroblastlar (MFS) patogenezinde rolleri ve tümör mikro hem yara iyileşmesi ve promosyon katkıları için artan ilgi kazanmaktadır. Şu anda mide-bağırsak (GI) dokulardan MFS izolasyonu için bir çok teknik vardır, ancak bu protokol, dondurulmuş dokudan bu stromal hücrelerin izolasyonu için yeni bir elemanı getirmektedir. GI doku örneklerinin Donma sadece dünya işbirlikçileri, biyobankalar ve ticari satıcılardan örnekleri elde etmek için araştırmacı, aynı zamanda taze örneklerin gecikmeli işleme izin verir. Açıklanan protokol sürekli belirteçleri CD90, α-SMA ve vimentin ifade MF fenotip ile karakteristik iğ şekilli hücreler verecektir. Bu hücreler, hasta örneklerinden türetilmiş olarak, pil kullanımı aynı zamanda hastalık durumlarında-, yani kanser ve enflamatuar barsak hastalıkları arasından yakın taklit MFS'de yararı kazandırmaktadır. Bu teknik arı vardırn mide, ince bağırsak, kolon ve MF primer kültür nesil valide. Birincil MF kültürleri pasaj bir dizi üzerinden deney geniş bir dizi de kullanılabilir ve bunların saflığı hem immünositokimya değerlendirilmiş ve akış sitometri analizine.
Introduction
Miyofibroblastlar / fibroblastlar (MFS), gastrointestinal (Gİ) mukoza hücrelerinin bol nüfusu temsil etmektedir. Bu stromal hücreler sadece epiteli altında bulunan ve bağırsaktaki mukozal lamina propria içinde birbirine bir ağ oluştururlar. MFS olmayan hücre dışı matrisin birikmesine sadece sorumludur, ancak parakrin düzenleme içinden geçen bitişik epitel 1, 2 elektrolit taşıma, iadesini ve bariyer işlevini etkileyebilir. Dahası, MFS enflamasyon ve doku önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir 3, 4 biçimlenme. miyofibroblastlar onlar da kanserle ilişkili fibroblastlar olarak bilinir tümör mikro, kritik bir parçası olan ve tümör hücre büyümesine katkı ve kanser kök hücreleri 3 için niş olarak hizmet vermektedir. Ortaya çıkan veriler, MFS ayrıca yerel antijen sunan hücreler hizmet olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca, MFS işlevi doğal ve kazanılmış bağışıklık tepkilerinin önemli düzenleyiciler, süredensitokinler ve büyüme faktörleri 5 çeşitli dans ediyorum.
Sağlıklı bireylerde, MFS hücreleri Bu hücreler aynı zamanda vimentin için pozitif. Mezenkimal kök hücrelerinden ayırt ve hücre yüzeyinde, mezenkimal marker, CD90 3, 5 tarihinde ifade inanılmaktadır, ancak epitelyal ve hematopoetik hücre belirteci, EpCAM ve CD45 negatif sırasıyla. Miyofibroblastların fibroblastlar aktive edilmiş bir şekli olması önerilmektedir ve α-SMA 5 ifadesi ile aktif olmayan fibroblastlardan ayırt edilebilir.
Geçtiğimiz on yıl içinde, insan kolon mukozasının gelen miyofibroblastlar izolasyonu için birden yaklaşımlar yayınlanan-çoğunlukla başlangıçta Mahida ve ark., 5-8 açıklanan yönteme dayalı olarak oylandı. Bireysel çalışmalar, çeşitli bağırsak mukozasında, çoklu gastrointestinal alanlar (yani, mide, küçük ve l'den MFS izolasyonu için hiçbir evrensel protokolü izolasyon prosedürleri rapor ederkenARGE intestinal mukoza) yayınlanmıştır. Bu tarifnamede sunulan protokol test edilmiş ve başarılı bir şekilde, yukarıda belirtilen dokuların her üç tip kullanılmaktadır. . Ayrıca, dondurulmuş GI mukozasından MF oranı pratisyen izole edilmesi için prosedürlerin rapor edilmemiştir.
Burada, enzimatik sindirimi dayalı optimize edilmiş bir yöntem sunmak ve aynı zamanda kültür için insan bağırsak mukozal MFS izolasyonu sağlar ve taze sindirilmiş, tek hücre, mukozal hazırlıkları analiz akım sitometri. Bu teknik, güvenilir bir şekilde bir MF fenotipi olan primer kültürleri elde edilir. Bundan başka, aynı yöntemler yanı sıra, mide ve ince bağırsak dokularının dondurulmuş örneklerden MF oranı pratisyen izole etmek için kullanılabilir. Taze GI dokusundan rolü in izole edilmesi, daha önce tarif edilmiştir; Bununla birlikte, dondurulmuş örneklerin kullanımı birçok avantaj sunar. Yani, araştırmacılar capabi sahip dünya çapında işbirlikçileri herhangi bir sayıda toplamak ve depolamak dokuları mümkün olacaktırlity dondurulmuş doku örnekleri gemi. Ayrıca, araştırmacılar, mevcut deney programı ile çatışmaya izolasyon doku işleme ameliyathane ve / veya endoskopi paketi ve acil atılır doku toplama bulabilirsiniz. Ayrıca, cerrahi öngörülemeyen doğası nedeniyle, doku tedarik işleme doku için kalan süre sınırı, hangi çok geç gün oluşabilir. Daha sonra işlenmek için doku Donma bu zorlukları hafifleten.
Son olarak, bu yöntemler, başarılı şekilde kolorektal karsinom ve iltihaplı bağırsak hastalıkları gibi hastalık durumlarında, kolon, mide ve ince bağırsak rolü in izolasyon kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, potansiyel bir kanserli prognostik biyolojik ve terapötik bir hedef olarak stromal hücrelerin kritik önemi giderek artan ışığında, sadece araştırma uygulamaları için geliştirilen birlikte, daha sonra kullanılmak üzere "işlevsel" biospecimens dondurma kabiliyeti önemli bir avantaj sunmaktadır. Bu kişiselleştirilmiş tıp 10, 11 gelişimini ilerletmek için hizmet olarak ek araçlar hizmet edebilir, hangi klinik biorepository yaratılması için benzersiz bir avantaj o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).
Materials
| MEM, 1X | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
- Yamaguchi, H. et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485 (2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., & Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., & Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., & Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I. et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R. et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-1348 (1997).
- Roncoroni, L. et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7, 40 (2009).
- Pinchuk, I. V. et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori. Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798 (2013).
- Pinchuk, I. V. et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., & Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., & Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G. et al.Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., & Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215. (2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., & Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611. (2013).
- Schiller, J. H., & Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., & De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., & Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., & Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656 (2014).
