Isolatie van CD 90+ Fibroblast / Myofibroblasten van Human Frozen Maag Monsters
Summary
Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.
Abstract
Fibroblasten / myofibroblasten (MFS) is steeds meer aandacht voor hun rol in de pathogenese en hun bijdragen aan zowel de wondgenezing en de bevordering van de tumor micro-omgeving. Hoewel er momenteel vele technieken voor het isoleren van magnetische velden van gastrointestinale (GI) weefsels, dit protocol introduceert een nieuw element van isolatie van deze stromacellen uit bevroren weefsel. Bevriezing exemplaren GI weefsel niet alleen kan de onderzoeker om monsters uit de hele wereld collaborateurs, biobanken, en commerciële leveranciers te verwerven, maar maakt ook de vertraagde verwerking van verse monsters. De beschreven protocol zal consequent karakteristieke spoelvormige cellen opleveren met de MF fenotype dat de markers CD90, α-SMA en vimentine uiten. Omdat deze cellen zijn afgeleid van patiëntmonsters, het gebruik van primaire cellen verleent ook het voordeel nauw nabootsen magnetische velden van ziekten, namelijk kanker en inflammatoire darmziekten. Deze techniek heeft been gevalideerd in de maag, dunne darm en dikke MF primaire cultuur generatie. MF primaire kweken kan worden gebruikt in een breed scala van experimenten gedurende een aantal passage en hun zuiverheid beoordeeld door zowel immunocytochemie en flowcytometrie analyse.
Introduction
Myofibroblasten / fibroblasten (MFS) vertegenwoordigen een rijke populatie van cellen in de gastro-intestinale (GI) slijmvlies. Deze stromacellen liggen net onder het epitheel en vormen een verbonden netwerk binnen mucosale lamina propria van de darm. Macrofagen zijn niet alleen verantwoordelijk voor de afzetting van extracellulaire matrix, maar door paracriene regulering kan elektrolytentransport, restitutie en barrièrefunctie van de aangrenzende epitheel 1, 2 beïnvloeden. Bovendien zijn MFS aangetoond dat het een belangrijke rol speelt bij ontstekingen en weefsel remodeling 3, 4. Myofibroblasten een kritiek deel van de tumor micro-omgeving, waarbij ze ook bekend als kanker geassocieerde fibroblasten, en bijdragen aan de tumorcelgroei en dienen als een niche voor kanker stamcellen 3. Opkomende gegevens suggereren dat magnetische velden ook kan dienen als lokale antigeen presenterende cellen. Bovendien, MFS functie als belangrijke regulatoren van aangeboren en adaptieve immuunreacties, producing diverse cytokines en groeifactoren 5.
Bij gezonde individuen wordt MFS cellen aangenomen differentiëren van mesenchymale stamcellen en expressie op hun celoppervlak, de mesenchymale marker, CD90 3, 5. Deze cellen zijn positief voor vimentine, maar negatief voor epitheel en hematopoietische cellen marker, EpCAM en CD45 respectievelijk. Myofibroblasten worden voorgesteld om een geactiveerde vorm van fibroblasten en kan worden onderscheiden van niet-geactiveerde fibroblasten door de expressie van α-SMA 5.
In het afgelopen decennium, verschillende benaderingen voor het isoleren van myofibroblasten uit humane colon mucosa gepubliceerd-grotendeels gebaseerd op de werkwijze die oorspronkelijk beschreven door Mahida et al. 5-8. Terwijl individuele studies rapporteren isolatieprocedures uit verschillende darmmucosa, geen algemeen protocol voor de isolatie van magnetische velden van meerdere gebieden van het maagdarmkanaal (bijv maag, kleine large darmslijmvlies) is gepubliceerd. De hierin gepresenteerde protocol getest en met succes gebruikt voor alle drie type weefsel hierboven vermeld. . Bovendien zijn procedures voor het isoleren Macrofagen uit bevroren GI slijmvlies niet gerapporteerd.
Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode, die is gebaseerd op enzymatische vertering en tegelijkertijd zorgt voor de isolatie van menselijke darm mucosale MF cultuur en flowcytometrie analyse vers geknipt eencellige mucosale preparaten. Deze techniek levert betrouwbare primaire kweken met een MF fenotype. Verder kunnen dezelfde methoden worden gebruikt voor het isoleren MF uit ingevroren specimens van maag en dunne darm weefsels ook. Isolatie van myofibroblasten verse GI weefsel is eerder beschreven; echter, het gebruik van bevroren monsters biedt veel voordelen. Namelijk, zouden de onderzoekers in staat om te verzamelen en op te slaan weefsels uit een aantal medewerkers over de hele wereld die de capabilijkheid om het schip ingevroren weefselmonsters. Bovendien kunnen onderzoekers de inzameling van afgedankte weefsel uit de operatiekamer en / of endoscopie suite en onmiddellijke verwerking van het weefsel voor isolatie tot conflicten met hun huidige experimenten schema te vinden. Ook, vanwege de onvoorspelbare aard van de operatie, weefsels kan laat op de dag optreden, waarbij de tijd voor bewerking weefsel beperken. Bevriezen van weefsel voor latere verwerking zal deze uitdagingen te verbeteren.
Tenslotte, deze werkwijzen zijn met succes toegepast bij het isoleren van colon, maag en dunne darm myofibroblasten bij ziektetoestanden zoals colorectaal carcinoom en inflammatoire darmziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel dit protocol is ontwikkeld voor het onderzoek verzoek slechts in het licht van toenemende cruciale belang van stromale cellen als een kankervaccin prognostische biomarkers en therapeutisch doel, de mogelijkheid om "functionele" biospecimens om later invriezen biedt een aanzienlijk voordeel. Dit vertegenwoordigt een uniek voordeel voor het creëren van klinische biorepository, die als extra instrumenten kunnen serving de ontwikkeling van geneeskunde 10, 11 te bevorderen. Vergelijkbaar met de b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).
Materials
| MEM, 1X | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
- Yamaguchi, H. et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485 (2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., & Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., & Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., & Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I. et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R. et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-1348 (1997).
- Roncoroni, L. et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7, 40 (2009).
- Pinchuk, I. V. et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori. Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798 (2013).
- Pinchuk, I. V. et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., & Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., & Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G. et al.Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., & Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215. (2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., & Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611. (2013).
- Schiller, J. H., & Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., & De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., & Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., & Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656 (2014).
