Isolement de CD 90+ fibroblastes / myofibroblastes de spécimens humains congelés gastro-intestinaux
Summary
Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.
Abstract
Fibroblastes / myofibroblastes (PDE) ont gagné une attention croissante pour leur rôle dans la pathogenèse et leurs contributions à la fois la cicatrisation des plaies et la promotion du microenvironnement de la tumeur. Bien qu'il existe actuellement de nombreuses techniques pour l'isolement de la MFS de (GI) tissus gastro-intestinaux, ce protocole introduit un élément original de l'isolement de ces cellules stromales de tissu congelé. La congélation des échantillons de tissus de GI non seulement permet au chercheur d'acquérir des échantillons de collaborateurs à travers le monde, les biobanques et les fournisseurs commerciaux, il permet également le traitement retardé d'échantillons frais. Le protocole décrit va toujours produire des cellules fusiformes avec le phénotype caractéristique MF qui expriment les marqueurs CD90, α-SMA et la vimentine. Comme ces cellules sont dérivées à partir d'échantillons de patients, l'utilisation de cellules primaires confère également le bénéfice de la MFS imitant de près depuis des états pathologiques, à savoir le cancer et les maladies inflammatoires de l'intestin. Cette technique a l'abeillen validée dans l'estomac, l'intestin grêle et du côlon MF génération de culture primaire. MF cultures primaires peuvent être utilisés dans une vaste gamme d'expériences sur un certain nombre de passage et leur pureté évaluées à la fois par immunocytochimie et cytométrie de flux.
Introduction
Myofibroblastes / fibroblastes (PDE) représentent une population abondante de cellules dans gastro-intestinal (GI) muqueuse. Ces cellules stromales sont situés juste en dessous de l'épithélium et forment un réseau interconnecté à l'intérieur de la muqueuse de la lamina propria dans l'intestin. MF ne sont pas seulement responsables pour le dépôt de la matrice extracellulaire, mais par la réglementation paracrine peut influencer le transport de l'électrolyte, la restitution et la fonction de barrière de l'épithélium adjacente 1, 2. En outre, la MFS ont été montré à jouer un rôle clé dans l'inflammation et les tissus remodelage 3, 4. Myofibroblastes sont un élément important du microenvironnement de la tumeur, où ils sont également connus comme les fibroblastes associés au cancer, et de contribuer à la croissance des cellules tumorales et servent comme une niche pour les cellules souches du cancer 3. De nouvelles données suggèrent que MFS peut également servir de cellules présentatrices d'antigènes que locales. En outre, la fonction de FM des régulateurs importants de réponses immunitaires innées et adaptatives, produCing une variété de cytokines et de facteurs de croissance 5.
Chez les individus en bonne santé, des cellules MFs On pense que les différencier des cellules souches mésenchymateuses et d'exprimer sur leur surface cellulaire, le marqueur mésenchymateux, CD90 3, 5. Ces cellules sont également positives pour la vimentine, mais négatif pour épithéliale et le marqueur de cellules hématopoïétiques, EpCAM et CD45 respectivement. Les myofibroblastes sont proposés pour être une forme activée de fibroblastes et peuvent être distingués des fibroblastes non activées par l'expression d'α-SMA 5.
Au cours de la dernière décennie, plusieurs approches pour l'isolement de myofibroblastes de la muqueuse du côlon humain ont été publiés sur la base de la plupart du temps, la méthode décrite à l'origine par Mahida et al., 8.5. Bien que des études particulières signalent des modes opératoires d'isolement de divers muqueuse intestinale, aucun protocole universel pour l'isolement de MFs à partir de plusieurs régions du tractus gastro-intestinal (par exemple, de l'estomac, les petites et lmuqueuse intestinale ARGE) a été publié. Le protocole présenté ici a été testée et utilisée avec succès pour tous les trois type de tissu mentionné ci-dessus. . En outre, les procédures pour isoler les CM de la muqueuse gastro-intestinaux congelés ont pas été signalés.
Ici, nous présentons une méthode optimisée, qui est basé sur la digestion enzymatique, et permet en même temps pour l'isolement de la muqueuse de l'intestin humain MF pour la culture et la cytométrie en flux analyse fraîchement digérés, monocellulaires, préparations muqueuses. Cette technique donne de manière fiable des cultures primaires avec un phénotype MF. En outre, les mêmes méthodes peuvent être utilisées pour isoler les CM à partir de spécimens congelés de tissus intestinaux et gastriques petits ainsi. Isolement de myofibroblastes de tissu frais GI a été décrite précédemment; cependant, l'utilisation des échantillons congelés présente de nombreux avantages. A savoir, les chercheurs seront en mesure de recueillir et de stocker des tissus de tout nombre de collaborateurs à travers le monde qui ont la capacilité à expédier des échantillons de tissus congelés. En outre, les chercheurs peuvent trouver la collection de tissus enlevés de la salle d'opération et / ou salle d'endoscopie et le traitement immédiat du tissu pour l'isolement en conflit avec leur horaire de l'expérimentation en cours. Aussi, en raison de la nature imprévisible de la chirurgie, l'obtention de tissus peut se produire très tard dans la journée, ce qui limitera le temps restant pour le tissu de traitement. Geler les tissus pour un traitement ultérieur sera atténuer ces défis.
Enfin, ces méthodes ont été utilisées avec succès dans l'isolement des myofibroblastes intestinale du côlon, de l'estomac et dans les petits états pathologiques tels que le cancer colorectal et les maladies inflammatoires de l'intestin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que ce protocole a été développé pour l'application de recherche uniquement, à la lumière de l'importance croissante critique de cellules stromales comme un cancer potentiels biomarqueurs pronostiques et cible thérapeutique, la capacité de geler biospécimens «fonctionnelles» pour une utilisation ultérieure offre un avantage significatif. Cela représente un avantage unique pour la création de banques de tissus biologiques cliniques, qui peuvent servir d'outils supplémentaires servant à fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).
Materials
| MEM, 1X | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
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