인간의 냉동 위장 표본에서 CD 90+ 섬유 아세포 / 근섬유 아세포의 분리
Summary
Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.
Abstract
섬유 아세포 / 근육 섬유 모세포 (MFS)의 발병 기전에서의 역할과 종양 미세 환경 모두 상처 치유 및 홍보에 대한 그들의 공헌 증가 주목을 받고있다. 현재 위장관 (GI) 조직에서 MFS의 분리를위한 많은 기술이 있지만,이 프로토콜은 냉동 조직에서 이러한 기질 세포의 분리의 새로운 요소를 소개합니다. GI 조직 표본을 동결하는 것은뿐만 아니라 전 세계적으로 공동, 바이오 뱅크, 상업 공급 업체의 샘플을 수집 할 수있는 연구자가, 그것도 신선한 샘플의 지연 처리를 허용 할 수 있습니다. 설명 프로토콜은 지속적으로 마커 CD90, α-SMA 및 멘틴을 표현 MF 표현형과 특성 스핀들 모양의 세포를 얻을 것입니다. 이러한 세포가 환자 샘플에서 유래 된 바와 같이, 일차 전지의 사용은 질환 상태 – 즉 암 및 염증성 장 질환으로부터 가깝게 모방 MFS의 이점을 부여한다. 이 기술은 꿀벌이N 위, 소장 및 대장 MF 차 문화 발전에 확인. MF 일차 배양 통로 걸쳐 실험의 광대 한 배열로 사용될 수 있고, 그 순도는 모두 면역 세포 화학 분석에 의해 평가하고, 유동 세포 계측법.
Introduction
근섬유 아세포는 / 섬유 아세포 (MFS)은 위장관 점막 세포의 풍부한 인구를 나타냅니다. 이러한 기질 세포는 상피 아래에 위치하며, 장내 점막 고유 층 내에서 상호 연결된 네트워크를 형성하고 있습니다. MFS하지 외 기질의 증착 만 담당하지만, 분비 조절을 통해 인접한 상피 1, 2의 전해질 수송 반발 및 장벽 기능에 영향을 미칠 수있다. 또한, MFS 염증 및 조직에서 중요한 역할을하는 것으로 나타났다 3,4- 리모델링. 근섬유 아세포는 또한 암 – 관련 아세포로 알려진 종양 미세 환경의 중요한 부분이며, 종양 세포 성장에 기여 암 줄기 세포 (3)에 대한 틈새의 역할을한다. 신흥 데이터는 MFS는 또한 지역의 항원 제시 세포를 제공 할 수 있음을 시사한다. 또한, MFS 기능 타고난 및 적응 면역 반응의 중요한 규제, produ의사이토 카인과 성장 인자 (5)의 다양한 향하도록.
건강한 사람에서, MFS 세포는이 세포는 vimentin에 긍정적이다. 중간 엽 줄기 세포로부터 분화와 그 세포 표면, 중간 엽 마커, CD90 3, 5에 표현하는 것으로되어 있지만, 상피 및 조혈 세포 마커는 EpCAM과 CD45에 대한 부정적인 각각. 근섬유 아세포가 섬유 아세포의 활성화 된 형태로 제시되고, α-SMA (5)의 식에 의해 비 활성화 된 섬유 아세포에서 구별 될 수있다.
지난 10 년 동안, 인간 대장 점막에서 근육 섬유 모세포의 분리를위한 여러 방법이 게시-주로 원래 Mahida 외. 5-8에서 기술 된 방법에 기초하고있다. 개별 연구는 다양한 장내 점막, 여러 위장관의 영역 (즉, 위, 작은 l로부터 MFS의 분리에 대한 더 보편적 인 프로토콜에서 분리 절차를보고 있지만ARGE 장 점막)이 출판되었습니다. 본 명세서에서 프로토콜은 테스트를 성공적으로 상술 한 조직의 세 종류에 사용되어왔다. . 또한, 냉동 GI 점막에서 MFS를 단리하기위한 절차는보고되지 않았다.
여기, 우리는 효소 소화를 기반으로하는 최적화 된 방법을 제시하고, 동시에 문화에 대한 인간의 장내 점막 MFS의 분리를 허용 갓 소화, 단일 세포, 점막 준비에 분석 유동 세포 계측법. 이 기술은 확실하게 MF 표현형과 차 문화를 산출한다. 또한, 동일한 방법뿐만 아니라 위 및 소장 동결 조직 시료로부터 MFS를 분리하는데 사용될 수있다. 신선한 GI 조직으로부터 근육 섬유 모세포의 분리는 전술 한 내용; 그러나, 냉동 검체의 사용은 많은 이점을 제공한다. 즉, 연구자들은 capabi가 전 세계에 걸쳐 공동 작업자의 숫자에서 수집하고 저장하는 조직 할 수있을 것입니다lity 냉동 조직 샘플을 제공합니다. 또한, 연구진은 현재 실험 일정과 충돌에 절연을위한 조직을 처리 수술실 및 / 또는 내시경 제품군 즉시에서 폐기 조직의 컬렉션을 찾을 수 있습니다. 또한, 수술의 예측할 수없는 특성으로 인해, 조직 조달은 처리 조직에 대해 남아있는 시간을 제한 할 매우 늦게 하루에 발생할 수 있습니다. 나중에 처리를 위해 조직을 동결하는 것은 이러한 문제를 개선 할 것이다.
마지막으로,이 방법은 성공적으로 대장 암과 염증성 장 질환 등의 질병 상태에서, 대장 위 및 소장 근육 섬유 모세포의 분리에 활용되고있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 잠재적 인 암 예후 바이오 마커 및 치료 대상으로 기질 세포의 매우 중요한 성장의 빛만을 조사 어플리케이션을 위해 개발되었지만, 나중에 사용하기 위해 "기능적"biospecimens을 고정 할 수있는 능력은 상당한 이점을 제공한다. 이 개인화 된 약 10, 11의 개발을 진행하는 역할을하는 등의 추가 도구를 제공 할 수있는, 임상 biorepository의 생성을위한 독특한 장점을 나타낸…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).
Materials
| MEM, 1X | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
- Yamaguchi, H. et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485 (2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., & Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., & Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., & Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I. et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R. et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-1348 (1997).
- Roncoroni, L. et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7, 40 (2009).
- Pinchuk, I. V. et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori. Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798 (2013).
- Pinchuk, I. V. et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., & Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., & Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G. et al.Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., & Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215. (2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., & Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611. (2013).
- Schiller, J. H., & Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., & De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., & Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., & Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656 (2014).
