Выделение CD 90+ фибробластов / Миофибробласты от человека замороженные желудочно-кишечного тракта образцов
Summary
Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.
Abstract
Фибробласты / миофибробласты (МФС) были набирает все большее внимание на их роли в патогенезе и их вклад в обоих заживления ран и продвижения микросреды опухоли. В то время как в настоящее время существует много методов для выделения МП от желудочно-кишечных (GI) тканей, этот протокол вводит новый элемент изоляции этих стромальных клеток из замороженной ткани. Замораживание И. образцов тканей не только позволяет исследователю получить образцы из мира сотрудников, биобанках и коммерческих поставщиков, это также позволяет задержки обработки свежих образцов. Описанный протокол будет последовательно дают характерные веретенообразные клетки с фенотипом MF, которые выражают маркеры CD90, α-SMA и Виментин. Поскольку эти клетки получают из клинических образцов, использование первичных клеток также дает преимущество в тесном имитирующих МЖ от болезненных состояний, а именно рака и воспалительных заболеваний кишечника. Этот метод имеет пчелап утверждена в желудка, тонкой кишки, толстой и MF поколения основной культуры. Первичные культуры MF могут быть использованы в широкий спектр экспериментов в течение нескольких прохода и их чистота оценена как иммуногистохимии и проточной цитометрии анализа.
Introduction
Миофибробласты / фибробласты (МЖ) представляют собой обильные популяции клеток в желудочно-кишечном (GI) слизистой оболочки. Эти клетки стромы расположены непосредственно под эпителием и образуют взаимосвязанную сеть в собственной пластинке слизистой оболочки в кишечнике. МЖ не отвечает только за осаждения внеклеточного матрикса, а через паракринной регулирования могут влиять на транспорт электролита, реституции, и барьерную функцию прилегающей эпителия 1, 2. Кроме того, МЖ, как было показано, играют ключевую роль в воспалении и ткани реконструкции 3, 4. Миофибробласты являются важной частью микросреды опухоли, где они также известный как рак, связанный фибробластов, и способствовать росту опухолевых клеток и служить нишей для раковых стволовых клеток 3. Новые данные свидетельствуют о том, что МЖ может также служить в качестве местных антиген-представляющих клеток. Кроме того, функция МЖ, как важные регуляторы врожденной и адаптивной иммунных реакций, произвоCing различные цитокины и факторы роста 5.
У здоровых лиц, MFS клетки, как полагают, отличить от мезенхимальных стволовых клеток и выразить их клеточной поверхности, мезенхимной маркера, CD90 3, 5. Эти клетки также положительно для виментина, но отрицательный для эпителиальных и гемопоэтических маркера клеток, ЕрСАМ и CD45 соответственно. Миофибробласты предложены, чтобы быть активированной формы фибробластов и можно отличить от неактивированных фибробластов по экспрессии a-SMA 5.
За последние десять лет, множественные подходы к изоляции миофибробластов из слизистой оболочки толстой кишки человека были опубликованы в основном-на основе метода, впервые описанной Mahida др. 5-8. Хотя отдельные исследования сообщают процедуры изоляции из различных слизистой кишечника, не универсальный протокол для изоляции МЖ из нескольких областей желудочно-кишечного тракта (например, желудка, малого и лАРГЕ слизистая оболочка кишечника) была опубликована. Протокол, представленные здесь, была испытана и успешно использован для всех трех типов ткани, упомянутых выше. , Кроме того, не сообщалось процедуры выделения МЖ из замороженных слизистой оболочки ЖКТ.
Здесь мы представляем оптимизированную метод, который основан на ферментативной пищеварения и одновременно позволяет для выделения человеческого слизистой кишечника МЖ для культуры и проточной цитометрии анализа свежих переваривается, одноклеточных, слизистых препаратов. Этот метод дает надежно первичных культур с фенотипа MF. Кроме того, одни и те же методы могут быть использованы для выделения МЖ из замороженных образцов желудочного и тонкого кишечника, а также тканей. Выделение миофибробластами из свежих GI ткани было описано ранее; Однако, использование замороженные образцы представляет множество преимуществ. А именно, исследователи смогут собирать и хранить ткани из любого количества сотрудников по всему миру, которые имеют capabiмируемости грузить образцы замороженной ткани. Кроме того, исследователи могут найти коллекцию отбрасываются ткани от операционной и / или эндоскопического кабинета и немедленной обработки ткани для изоляции к конфликту с их нынешним графиком экспериментов. Кроме того, из-за непредсказуемого характера операции, закупки ткани может произойти в самом конце дня, который будет ограничивать время, оставшееся для обработки ткани. Замораживание ткани для последующей обработки будет улучшить эти проблемы.
Наконец, эти методы были успешно использованы в изоляции толстой, желудка и тонкого кишечника миофибробластами в болезненных состояний, таких как карциномы и колоректального воспалительных заболеваний кишечника.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя этот протокол был разработан для исследования применения только в свете растущей критическую важность стромальных клеток в качестве потенциального рака прогностических биомаркеров и терапевтической мишени, способность заморозить "функциональные" biospecimens для последующего…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).
Materials
| MEM, 1X | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
- Yamaguchi, H. et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485 (2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., & Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., & Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., & Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I. et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R. et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-1348 (1997).
- Roncoroni, L. et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7, 40 (2009).
- Pinchuk, I. V. et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori. Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798 (2013).
- Pinchuk, I. V. et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., & Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., & Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G. et al.Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., & Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215. (2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., & Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611. (2013).
- Schiller, J. H., & Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., & De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., & Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., & Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656 (2014).
