Aislamiento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de congelados Humanos gastrointestinales Especímenes
Summary
Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.
Abstract
Fibroblastos / miofibroblastos (MFS) han ido ganando cada vez más atención por su papel en la patogénesis y sus contribuciones a tanto la cicatrización de heridas y la promoción del microambiente tumoral. Si bien en la actualidad hay muchas técnicas para el aislamiento de FMs de (GI) tejidos gastrointestinales, este protocolo introduce un elemento novedoso de aislamiento de estas células del estroma de tejido congelado. Congelar las muestras de tejido GI no sólo permite al investigador para adquirir muestras de colaboradores en todo el mundo, los biobancos y proveedores comerciales, sino que también permite el procesamiento retardado de muestras frescas. El protocolo descrito producirá consistentemente células fusiformes característicos con el fenotipo MF que expresan los marcadores CD90, α-SMA y vimentina. A medida que estas células se derivan de muestras de los pacientes, el uso de células primarias también confiere el beneficio de MFs que imitan estrechamente a partir de los estados-a saber, la enfermedad del cáncer y enfermedades inflamatorias del intestino. Esta técnica tiene la abejan validado en gástrico, intestino delgado, colon y MF generación cultivo primario. Culturas MF primarios se pueden utilizar en una amplia gama de experimentos sobre un número de pasaje y su pureza evaluados tanto por inmunocitoquímica y análisis de citometría de flujo.
Introduction
Los miofibroblastos / fibroblastos (MFS) representan una abundante población de células en el tracto gastrointestinal (GI) mucosa. Estas células estromales se encuentran justo por debajo del epitelio y forman una red interconectada dentro de la lámina propia de la mucosa en el intestino. MFs no sólo sean responsables de la deposición de la matriz extracelular, pero a través de la regulación paracrina puede influir en el transporte de electrolitos, restitución, y la función de barrera del epitelio adyacente 1, 2. Además, MFs han demostrado que desempeñan un papel clave en la inflamación y el tejido remodelación de 3, 4. Los miofibroblastos son una parte crítica del microambiente tumoral, en donde también se les conoce como los fibroblastos asociados al cáncer, y contribuyen al crecimiento de las células tumorales y sirven como un nicho de células madre del cáncer 3. Datos emergentes sugieren que FMs también puede servir células presentadoras de antígenos como locales. Además, la función FMs como reguladores importantes de la respuesta inmune innata y adaptativa, producing una variedad de citocinas y factores de crecimiento 5.
En individuos sanos, las células MFS se cree que diferenciar de las células madre mesenquimales y expresar en su superficie celular, el marcador mesenquimal, CD90 3, 5. Estas células también son positivas para vimentina, pero negativo para epitelial y marcador de células hematopoyéticas, EpCAM y CD45 , respectivamente. Los miofibroblastos se sugieren para ser una forma activada de los fibroblastos y pueden distinguirse de los fibroblastos no activadas por la expresión de α-SMA 5.
Durante la última década, múltiples enfoques para el aislamiento de miofibroblastos de colon humanos mucosa han sido publicados-en su mayoría basados en el método descrito originalmente por Mahida et al. 5-8. Mientras que los estudios individuales reportan procedimientos de aislamiento de diversos mucosa intestinal, no protocolo universal para el aislamiento de MFs desde múltiples áreas del tracto GI (es decir, gástrica, pequeño y lmucosa intestinal arge) ha sido publicado. El protocolo presentado en el presente documento ha sido probado y utilizado con éxito para los tres tipo de tejido se ha mencionado anteriormente. . Además, no se han informado procedimientos para aislar MFs de la mucosa GI congelados.
A continuación, presentamos un método optimizado, que se basa en la digestión enzimática, y al mismo tiempo permite el aislamiento de la mucosa intestinal humana FMs de la cultura y la citometría de flujo análisis, unicelulares, preparaciones mucosas digeridos recientemente. Esta técnica produce de forma fiable cultivos primarios con un fenotipo MF. Además, los mismos métodos pueden ser utilizados para aislar a partir de muestras MFs congeladas de tejidos intestinales y gástricos pequeñas también. Aislamiento de miofibroblastos a partir de tejido fresco GI se ha descrito previamente; sin embargo, la utilización de muestras congeladas presenta muchos beneficios. A saber, los investigadores podrán recoger y almacenar los tejidos de cualquier número de colaboradores de todo el mundo que tienen la capabidad para enviar muestras de tejido congelado. Por otra parte, los investigadores pueden encontrar la colección de tejidos descartados de la sala de operaciones y / o sala de endoscopia e inmediato procesamiento de tejido para el aislamiento de conflicto con su horario de experimentación actual. También, debido a la naturaleza impredecible de la cirugía, la obtención de tejidos puede ocurrir muy tarde en el día, lo que limitará el tiempo que queda para el tejido procesado. La congelación de tejido para su posterior procesamiento será mejorar estos desafíos.
Por último, estos métodos se han utilizado con éxito en el aislamiento de miofibroblastos intestinales del colon, gástricos y pequeños en estados de enfermedad tales como carcinoma colorrectal y enfermedades inflamatorias del intestino.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque este protocolo fue desarrollado para la aplicación de investigación única, a la luz de la creciente importancia crítica de las células del estroma como un posible cáncer de biomarcadores pronósticos y diana terapéutica, la capacidad de congelar bioespecímenes "funcionales" para su uso posterior ofrece una ventaja significativa. Esto representa una ventaja única para la creación de biorepositorio clínica, que puede servir como herramientas adicionales que sirven para avanzar en el desarrollo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).
Materials
| MEM, 1X | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
- Yamaguchi, H. et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485 (2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., & Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., & Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., & Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I. et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R. et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-1348 (1997).
- Roncoroni, L. et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7, 40 (2009).
- Pinchuk, I. V. et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori. Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798 (2013).
- Pinchuk, I. V. et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., & Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., & Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G. et al.Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., & Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215. (2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., & Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611. (2013).
- Schiller, J. H., & Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., & De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., & Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., & Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656 (2014).
