人間の冷凍消化管標本からCD 90 +線維芽細胞/筋線維芽細胞の単離
Summary
Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.
Abstract
線維芽細胞/筋線維芽細胞（mfsが）病因におけるそれらの役割と腫瘍微小環境の両方の創傷治癒やプロモーションへの貢献のためにますます注目を集めています。現在、胃腸（GI）組織からのMFsを単離するための多くの技術がありますが、このプロトコルは、凍結組織からこれらの間質細胞の単離の新規要素を紹介します。 GI組織標本を凍結するだけでなく、世界中の共同研究者、バイオバンク、および商業ベンダーからサンプルを取得するために研究者が、それはまた、新鮮なサンプルの遅延処理を可能にすることができます。記載されているプロトコルは、一貫して、マーカーCD90、α-SMAおよびビメンチンを表現MF表現型と特徴紡錘状細胞が得られます。これらの細胞は患者のサンプルから誘導されるように、一次細胞の使用は、疾患状態、すなわち癌および炎症性腸疾患に密接に模倣するのMFsの利点を与えます。この技術は蜂を持っていますnは、胃、小腸、および結腸MF初代培養世代で検証。初代MF培養は、通路の数を超える実験の広大な配列で使用することができ、それらの純度は、両方の免疫細胞化学によって評価し、フローサイトメトリー分析。
Introduction
筋線維芽細胞/線維芽細胞（mfsが）胃腸（GI）粘膜内の細胞の豊富な集団です。これらの間質細胞だけ上皮の下に位置し、腸内の粘膜固有層内の相互接続ネットワークを形成しています。 mfsがばかりでなく、細胞外マトリックスの沈着の原因であるが、パラクリン調節を介して電解質輸送、回復、および隣接する上皮1,2のバリア機能に影響を与えることができる。さらに、mfsが炎症および組織において重要な役割を果たすことが示されています3、4改造。筋線維芽細胞は、それらがまた、癌関連線維芽細胞として知られている腫瘍の微小環境の重要な一部であり、腫瘍細胞増殖に寄与し、癌幹細胞ニッチ3として機能します。新興データがmfsも、地元の抗原提示細胞として機能し得ることを示唆しています。さらに、のMFS機能自然免疫と適応免疫応答の重要な調節因子として、のproduサイトカインおよび増殖因子5の様々なcing。
健康な個体では、のMFS細胞は、これらの細胞は、ビメンチンに対して陽性である。間葉系幹細胞から分化し、それらの細胞表面、間葉系マーカー、CD90 3,5に発現すると考えられているが、上皮細胞および造血細胞マーカー、のEpCAMおよびCD45について陰性、それぞれ。筋線維芽細胞は、線維芽細胞の活性化形態であることが示唆されており、α-SMA 5の発現により活性化されていない線維芽細胞から区別することができます。
過去10年間、人間の結腸粘膜から筋線維芽細胞を単離するための複数のアプローチが発表され、大部分はもともとMahida ら 5-8に記載された方法に基づいています。個々の研究は、様々な腸粘膜から単離手順を報告しているが、GI管の複数の領域からのMFsを単離するための普遍的なプロトコル（ すなわち 、胃、小およびlARGE腸粘膜）が公開されています。本明細書に提示プロトコルがテストされ、正常に上記の組織のすべての3つのタイプに使用されています。 。また、冷凍GI粘膜からのMFsを単離するための手順が報告されていません。
ここでは、酵素消化に基づいて最適化された方法を提示し、同時に培養のための人間の腸粘膜のMFsの分離を可能にし、新たに消化し、単一の細胞、粘膜製剤中のフローサイトメトリー分析。この技術は確実にMF表現型と初代培養物を生成します。また、同様の方法は、同様に胃および小腸組織の凍結標本からのMFsを単離することができます。新鮮GI組織から筋線維芽細胞の単離は、以前に記載されています。しかし、冷凍標本の利用は、多くの利点を提供します。すなわち、研究者はcapabiを持っている世界中の協力者の任意の数から収集して保存組織することができるだろう凍結組織サンプルを出荷するリティ。また、研究者は、現在の実験スケジュールと競合への単離のための組織を処理し、手術室から廃棄された組織の収集および/または内視鏡検査スイートと即座に見つけることができます。また、手術の予測不可能な性質のために、組織の調達が処理組織のために残された時間が制限されている、非常に遅めの時間に発生することがあります。後の処理のために組織を凍結することは、これらの課題を改善します。
最後に、これらの方法は、正常結腸、胃および結腸直腸癌および炎症性腸疾患のような疾患状態における小腸筋線維芽細胞の単離に利用されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、唯一の研究用途のために開発されたが、潜在的な癌予後バイオマーカーおよび治療標的としての間質細胞の成長の重要な重要性に照らして、後で使用するために「機能的」生物試料を凍結する能力は重要な利点を提供しています。これは、個別化医療10、11の開発を進めるのに役立つなどの追加のツールとして機能し得る臨床バイオレポジトリーを作成するための?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).
Materials
| MEM, 1X | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
- Yamaguchi, H. et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485 (2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., & Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., & Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., & Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I. et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R. et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-1348 (1997).
- Roncoroni, L. et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7, 40 (2009).
- Pinchuk, I. V. et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori. Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798 (2013).
- Pinchuk, I. V. et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., & Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., & Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G. et al.Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., & Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215. (2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., & Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611. (2013).
- Schiller, J. H., & Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., & De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., & Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., & Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656 (2014).
