Summary

Aislamiento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de congelados Humanos gastrointestinales Especímenes

Published: January 31, 2016
doi:

Summary

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

Abstract

Fibroblastos / miofibroblastos (MFS) han ido ganando cada vez más atención por su papel en la patogénesis y sus contribuciones a tanto la cicatrización de heridas y la promoción del microambiente tumoral. Si bien en la actualidad hay muchas técnicas para el aislamiento de FMs de (GI) tejidos gastrointestinales, este protocolo introduce un elemento novedoso de aislamiento de estas células del estroma de tejido congelado. Congelar las muestras de tejido GI no sólo permite al investigador para adquirir muestras de colaboradores en todo el mundo, los biobancos y proveedores comerciales, sino que también permite el procesamiento retardado de muestras frescas. El protocolo descrito producirá consistentemente células fusiformes característicos con el fenotipo MF que expresan los marcadores CD90, α-SMA y vimentina. A medida que estas células se derivan de muestras de los pacientes, el uso de células primarias también confiere el beneficio de MFs que imitan estrechamente a partir de los estados-a saber, la enfermedad del cáncer y enfermedades inflamatorias del intestino. Esta técnica tiene la abejan validado en gástrico, intestino delgado, colon y MF generación cultivo primario. Culturas MF primarios se pueden utilizar en una amplia gama de experimentos sobre un número de pasaje y su pureza evaluados tanto por inmunocitoquímica y análisis de citometría de flujo.

Introduction

Los miofibroblastos / fibroblastos (MFS) representan una abundante población de células en el tracto gastrointestinal (GI) mucosa. Estas células estromales se encuentran justo por debajo del epitelio y forman una red interconectada dentro de la lámina propia de la mucosa en el intestino. MFs no sólo sean responsables de la deposición de la matriz extracelular, pero a través de la regulación paracrina puede influir en el transporte de electrolitos, restitución, y la función de barrera del epitelio adyacente 1, 2. Además, MFs han demostrado que desempeñan un papel clave en la inflamación y el tejido remodelación de 3, 4. Los miofibroblastos son una parte crítica del microambiente tumoral, en donde también se les conoce como los fibroblastos asociados al cáncer, y contribuyen al crecimiento de las células tumorales y sirven como un nicho de células madre del cáncer 3. Datos emergentes sugieren que FMs también puede servir células presentadoras de antígenos como locales. Además, la función FMs como reguladores importantes de la respuesta inmune innata y adaptativa, producing una variedad de citocinas y factores de crecimiento 5.

En individuos sanos, las células MFS se cree que diferenciar de las células madre mesenquimales y expresar en su superficie celular, el marcador mesenquimal, CD90 3, 5. Estas células también son positivas para vimentina, pero negativo para epitelial y marcador de células hematopoyéticas, EpCAM y CD45 , respectivamente. Los miofibroblastos se sugieren para ser una forma activada de los fibroblastos y pueden distinguirse de los fibroblastos no activadas por la expresión de α-SMA 5.

Durante la última década, múltiples enfoques para el aislamiento de miofibroblastos de colon humanos mucosa han sido publicados-en su mayoría basados ​​en el método descrito originalmente por Mahida et al. 5-8. Mientras que los estudios individuales reportan procedimientos de aislamiento de diversos mucosa intestinal, no protocolo universal para el aislamiento de MFs desde múltiples áreas del tracto GI (es decir, gástrica, pequeño y lmucosa intestinal arge) ha sido publicado. El protocolo presentado en el presente documento ha sido probado y utilizado con éxito para los tres tipo de tejido se ha mencionado anteriormente. . Además, no se han informado procedimientos para aislar MFs de la mucosa GI congelados.

A continuación, presentamos un método optimizado, que se basa en la digestión enzimática, y al mismo tiempo permite el aislamiento de la mucosa intestinal humana FMs de la cultura y la citometría de flujo análisis, unicelulares, preparaciones mucosas digeridos recientemente. Esta técnica produce de forma fiable cultivos primarios con un fenotipo MF. Además, los mismos métodos pueden ser utilizados para aislar a partir de muestras MFs congeladas de tejidos intestinales y gástricos pequeñas también. Aislamiento de miofibroblastos a partir de tejido fresco GI se ha descrito previamente; sin embargo, la utilización de muestras congeladas presenta muchos beneficios. A saber, los investigadores podrán recoger y almacenar los tejidos de cualquier número de colaboradores de todo el mundo que tienen la capabidad para enviar muestras de tejido congelado. Por otra parte, los investigadores pueden encontrar la colección de tejidos descartados de la sala de operaciones y / o sala de endoscopia e inmediato procesamiento de tejido para el aislamiento de conflicto con su horario de experimentación actual. También, debido a la naturaleza impredecible de la cirugía, la obtención de tejidos puede ocurrir muy tarde en el día, lo que limitará el tiempo que queda para el tejido procesado. La congelación de tejido para su posterior procesamiento será mejorar estos desafíos.

Por último, estos métodos se han utilizado con éxito en el aislamiento de miofibroblastos intestinales del colon, gástricos y pequeños en estados de enfermedad tales como carcinoma colorrectal y enfermedades inflamatorias del intestino.

Protocol

El protocolo para la obtención de tejidos humanos descartados de pacientes quirúrgicos y el establecimiento de cultivos primarios fue aprobado por la Universidad de Texas Medical Branch y la Universidad de Nuevo México Juntas de Revisión Institucional. Los requisitos generales para la obtención de muestras de tejido humano se describen a continuación. Tenga en cuenta que desde MFs puede ser aislado de tejido congelado, bancos de datos genéticos y vendedores comerciales son también opciones viables. <p class=…

Representative Results

El uso de este protocolo de digestión enzimática, hemos sido siempre capaz de aislar y crecer CD90 + células estromales de la mucosa intestinal MF población a partir de muestras y biopsias (Figura 1) quirúrgicas gastrointestinales. Visible la proliferación de colonias MF se pudo observar en el día 2 – 5 después de la siembra suspensiones de células mononucleares en placas de 6 pocillos (Figura 1A-B). Los cultivos primarios MF alcanzan…

Discussion

Aunque este protocolo fue desarrollado para la aplicación de investigación única, a la luz de la creciente importancia crítica de las células del estroma como un posible cáncer de biomarcadores pronósticos y diana terapéutica, la capacidad de congelar bioespecímenes "funcionales" para su uso posterior ofrece una ventaja significativa. Esto representa una ventaja única para la creación de biorepositorio clínica, que puede servir como herramientas adicionales que sirven para avanzar en el desarrollo …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).

Materials

MEM, 1X Corning MT-10-010-CV
Hanks' Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H6648
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636
Antibiotic-Antimycotic, 100X Gibco 15240-062
Ciprofloxacin HCl Corning 61-277-RF
L-Glutamine, 100x Corning 25-005-CI
MEM Nonessential Amino Acids Corning 25-025-CI
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max Sigma-Aldrich D2650
DL-Dithiothreitol solution (DTT) Sigma-Aldrich 646563
0.5M EDTA, pH 8.0 Cellgro 46-034-CI
DNAse Worthington LS002139
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I Sigma-Aldrich C1639
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II Sigma-Aldrich C1764
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV Sigma-Aldrich C5138
Accumax cell dissociation solution Sigma-Aldrich A7089
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10227
Cell Strainer (70µm) Corning 352350
PE Mouse Anti-Human Vimentin BD Biosciences 562337 Clone RV202
FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle Sigma-Aldrich F3777 Clone 1A4
APC Mouse Anti-Human CD90 BD Biosciences 559869 Clone 5E10

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Cite This Article
Johnson, P., Beswick, E. J., Chao, C., Powell, D. W., Hellmich, M. R., Pinchuk, I. V. Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens. J. Vis. Exp. (107), e53691, doi:10.3791/53691 (2016).

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