Driedimensionale Super resolutie microscopie van de F-actine filamenten door interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM)
Summary
We presenteren een protocol voor de toepassing van interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM), een 3-dimensionale single-molecule lokalisatie super resolutie microscopie methode, aan de beeldvorming van het actine cytoskelet in hechtende zoogdiercellen. Deze aanpak maakt het mogelijk op basis van licht visualisatie van nanoschaal structurele kenmerken die anders onopgelost zouden blijven door middel van conventionele diffractie beperkt optische microscopie.
Abstract
Fluorescentiemicroscopie maakt directe visualisatie van specifieke biomoleculen in cellen. Voor conventionele fluorescentiemicroscopie de ruimtelijke resolutie beperkt door diffractie tot ~ 200 nm in het beeldvlak en> 500 nm langs de optische as. Daardoor fluorescentiemicroscopie al lang ernstig beperkt in de waarneming van ultrastructurele kenmerken in cellen. De recente ontwikkeling van super-resolutie microscopie methoden heeft deze beperking te omzeilen. Met name de komst van photoswitchable fluoroforen maakt lokalisatie-based super resolutie microscopie, die oplossend vermogen het naderen van de moleculaire lengte schaal biedt. Hier beschrijven we de toepassing van een drie-dimensionale super-resolutie microscopie methode op basis van single-molecule lokalisatie microscopie en multifase interferometrie, genaamd interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM). Deze methode biedt bijna isotrope resolutie over deorde van 20 nm in alle drie dimensies. Protocollen voor het visualiseren van de filamenteuze actine cytoskelet, waaronder prepareren en de werking van het instrument iPALM, worden hier beschreven. Deze protocollen zijn ook gemakkelijk aan te passen en leerzaam voor de studie van andere ultrastructurele functies in cellen.
Introduction
De visualisatie van complexe celstructuren is al lang een integraal onderdeel van de biologische inzichten en ontdekking. Hoewel fluorescentie microscopie afbeeldingscellen met hoog moleculair specificiteit, het oplossend vermogen wordt beperkt door diffractie tot ~ 200 nm in het beeldvlak (x, y, of dwarsafmeting) en> 500 nm langs de optische as (z of axiale afmeting) 1,2. Vandaar dat de observatie van ultrastructurele kenmerken van oudsher beperkt tot elektronenmicroscopie (EM). Gelukkig heeft de recente ontwikkeling van super-resolutie microscopie deze limiet omzeild, waardoor ruimtelijke resolutie in de 10-100 nm 1-6. In het bijzonder, benaderingen super resolutie op basis van één molecuul lokalisatie, bekend onder acroniemen zoals PALM (Photoactivated Localization Microscopy) 4, FPALM (Fluorescence Photoactivated Localization Microscopy) 5 (d) STORM (direct Stochastic Optical Wederopbouw Microscopy) 6,7, PAINT ( point accumulatie for Imaging Nanoscale Topografie) 8, GSDIM (grondtoestand Uitputting Microscopy, gevolgd door individuele moleculaire return) 9 of SMACM (single-molecule Active-Control Microscopy) 10, evenals hun 3-dimensionale (3D) implementaties, zoals interferometrische PALM (iPALM) 11 of 3D-STORM 12, zijn waardevol in het onthullen van nieuwe inzichten in de nanoschaal organisatie van een groot aantal biologische structuren, met inbegrip van neuronale axonen en synapsen 13, focale adhesies 14,15, cel-cel kruispunten 16, nucleaire poriën 17 en centrosomes 18-20, een paar te noemen.
Een andere ultrastructurele functie in cellen voor die super-resolutie microscopie is potentieel bruikbaar is het actine cytoskelet. Het complex maaswerk van filamenteuze (f) actine in de cel cortex speelt een essentiële rol in de controle van celvorm en mechanische eigenschappen 21. De organisatie of f-actine wordt actief en dynamisch geregeld al tal van regulerende eiwitten die sterk beïnvloeden polymerisatie, verknoping, omzet, stabiliteit en netwerktopologie 22. Hoewel de karakterisering van F-actine maaswerk architectuur is belangrijk mechanistische inzichten in een diversiteit aan cellulaire processen, de kleine (~ 8 nm) van de f-actine filamenten belemmert de waarneming door gebruikelijke buigingsbegrensde lichtmicroscopie; dus de visualisatie van actine fijne structuur tot nu toe uitsluitend uitgevoerd door EM. Hier beschrijven we protocollen voor het visualiseren van de f-actine cytoskelet in hechtende zoogdiercellen, met behulp van de iPALM super resolutie microscopie techniek om te profiteren van de zeer hoge precisie capaciteit te nemen in 3D 11,23. Hoewel de iPALM instrument sterk gespecialiseerd heeft instructies over het opzetten van een dergelijk instrument is beschreven onlangs 23, terwijl de toegang tot de iPALM microscoop georganiseerd door de Howard Hughes Medical Institute is ook ter beschikking gesteld van de onderzoeksgemeenschap met minimale kosten. Bovendien, het prepareren hierin beschreven werkwijzen zijn direct toepasbaar op alternatieve 3D superresolutie benaderingen, zoals die gebaseerd op astigmatisch onscherpte in de puntspreidingsfunctie (PSF) 12 of bi-plane detectie 24, die breder beschikbaar zijn.
We merken op dat een noodzakelijk ingrediënt voor single-molecule lokalisatie-based super resolutie microscopie in het algemeen is de photoswitchable fluorofoor 25, waarin de drie kritische eisen voor single-molecule lokalisatie-based super resolutie microscopie maakt het mogelijk moet worden voldaan: i) high single-molecule helderheid en contrast ten opzichte achtergrondsignalen; ii) spaarzame distributie van enkele moleculen in een gegeven beeldframe; en iii) hoge ruimtelijke dichtheid etikettering voldoende om het profiel van de onderliggende structuur (ook bekend als Nyquist-Sha vangennNiet sampling criterium) 26. Zo bevredigende resultaten nadruk liggen eveneens op zowel de goede voorbereiding van monsters geplaatst fluorofoor photoswitching optimaliseren en de onderliggende ultrastructuur behouden, evenals de instrumentatie en verwervingsprocessen van de experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het optische systeem iPALM is gebaseerd op een 4-π dual-tegen objectief ontwerp, zoals weergegeven in figuur 1A. De instellingen worden geconstrueerd met zowel maat gefreesd en commerciële opto-mechanische onderdelen, zoals eerder beschreven 23 en in tabel 1. In aanvulling op onze opstelling, het Howard Hughes Medical Institute (HHMI) biedt onderdak aan een systeem dat toegankelijk is voor de wetenschappelijke wereld op het Advanced Imaging Center van de Ja…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YW en PK zeer erkentelijk voor financiële steun van de Singapore National Research Foundation, toegekend aan PK (NRF-NRFF-2011-04 en NRF2012NRF-CRP001-084). We danken ook de MBI geopende lab en microscopie kernfaciliteiten voor ondersteunende infrastructuur.
Materials
| optical table | Newport, CA | RS4000 | iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators |
| vibration isolator for optical table | Newport, CA | S-2000 | |
| laser-642 | Newport, CA | 1185055 | output power=100mw |
| laser-561 | Newport, CA | 1168931 | output power=200mw |
| laser-488 | Newport, CA | 1137970 | output power=200mw |
| laser-405 | Newport, CA | 1142279 | output power=100mw |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, NJ | BB1-E02 | laser combiner |
| dichroic beamsplitter | Semrock, NY | LM01-427-25 | |
| acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic, France | AOTFnC-VIS-TN | |
| Linear polarizer | Newport, CA | 05LP-VIS-B | |
| baseplate | local workshop | customized | |
| turning mirror (22.5°) | Reynard Corpporation, CA | customized | 22.5° mirror |
| motorized optic mounts | New Focus, CA | 8816 | |
| motorized XYZ translation stage | Thorlabs, NJ | MT3/M-Z6 | sample holder |
| T-Cube DC servo motor controller | Thorlabs, NJ | TDC001 | |
| Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente, Germany | S-303.CD | |
| objective lens | Nikon, Japan | MRD01691 | objective. Apo TIRF 60X/1.49oil |
| translation stage | New Focus, CA | 9062-COM-M | |
| Pico Motor Actuator | New Focus, CA | 8301 | |
| rotary Solenoid/Shutter | DACO Instruments, CT | 5423-458 | |
| 3-way beam splitter | Rocky Mountain Instruments, CO | customized | beamsplitter |
| Piezo Z/Tip/Tilt scanner | Physik Instrumente, Germany | S-316.10 | |
| motorized five-axis tilt aligner | New Focus, CA | 8081 | |
| Picmotor ethernet controller | New Focus, CA | 8752 | |
| Piezo controllers/amplifier/digital operation module | Physik Instrumente, Germany | E-509/E-503/E-517 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-523/20 | filters |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-588/21 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-607/30 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-676/37 | |
| notch filter | Semrock, NY | NF01-405/488/561/635 | |
| motorized filter wheel with controllter | Thorlabs, NJ | FW103H | |
| EMCCD | Andor, UK | DU-897U-CSO-#BV | 3 sets |
| Desktop computers for controlling cameras and synchronization | Dell | Precision T3500 | PC, 4 sets |
| coverslips with fiducial | Hestzig, VA | 600-100AuF | sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available |
| fibronectin | Millipore, MT | FC010 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 15710 | fixation. 16% |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 16220 | 25% |
| triton X-100 | Sigma aldrich, MO | T8787 | |
| HUVEC cells | Life Technologies, CA | C-015-10C | |
| Medium 200 | Life Technologies, CA | M-200-500 | |
| Large Vessel Endothelial Factors | Life Technologies, CA | A14608-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
| Pennicillin/Streptomycin | 15140122 | ||
| Trypsin/EDTA | Life Technologies, CA | 25200056 | |
| PIPES | Sigma aldrich, MO | P1851 | PHEM |
| HEPES | 1st base, Malaysia | BIO-1825 | |
| EGTA | Sigma aldrich, MO | E3889 | |
| MgCl2 | Millipore, MT | 5985 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen, CA | A22287 | staining |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma aldrich, MO | 480886 | quenching |
| glucose | 1st base, Malaysia | BIO-1101 | imaging buffer |
| glucose oxidase | Sigma aldrich, MO | G2133 | |
| catalase | Sigma aldrich, MO | C9322 | |
| cysteamine | Sigma aldrich, MO | 30070 | |
| Epoxy | Thorlabs, NJ | G14250 | |
| vaseline | Sigma aldrich, MO | 16415 | sample sealing |
| lanolin | Sigma aldrich, MO | L7387 | |
| parafin wax | Sigma aldrich, MO | 327204 | |
| Immersion oil | Electron Microscopy Sciences, PA | 16915-04 | imaging. Cargille Type HF |
References
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
- Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
- Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
- Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
- Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
- Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).
- Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
- Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).
- Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
- Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
- Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
- Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-492 (2010).
- Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).
- Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. 生物化学. 5, 467-477 (1966).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Shin, W. D., Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L., et al. . Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2010).
- Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
- Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. Visualization of Localization Microscopy Data. Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).
- El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
- Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
- Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
- Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
- Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
- Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279 (2011).
- Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).
