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生物学

Tridimensional Super Resolution Microscopia de filamentos de actina F por Interferometric fotoativado Localization Microscopy (iPALM)

Published: December 01, 2016
doi:
10.3791/54774
,
1Department of Biology,South University of Science and Technology of China, Shenzhen, 2Mechanobiology Institute, Singapore, 3Department of Biomedical Engineering,National University of Singapore

Summary

Nós apresentamos um protocolo para a aplicação de interferometria fotoativado Localization Microscopy (iPALM), um método de microscopia de super-resolução 3-dimensional única molécula localização, à imagem do citoesqueleto de actina em células de mamíferos aderentes. Esta abordagem permite a visualização à base de luz de características estruturais em nanoescala que, caso contrário permanecem sem solução por microscopia óptica limitado por difração convencional.

Abstract

microscopia de fluorescência permite a visualização direta das biomoléculas específicas dentro das células. No entanto, para a microscopia de fluorescência convencional, a resolução espacial é limitada por difracção para ~ 200 nm, dentro do plano de imagem e> 500 nm ao longo do eixo óptico. Como resultado, a microscopia de fluorescência tem sido severamente limitada na observação das características ultra-estruturais dentro de células. O recente desenvolvimento de métodos de microscopia de super-resolução tem superar essa limitação. Em particular, o advento dos fluoróforos foto induzida permite microscopia de super-resolução à base de localização, que fornece poder de resolução que se aproxima a escala de comprimento molecular. Aqui, descrevemos a aplicação de um método de microscopia de super resolução tridimensional baseado em microscopia de localização única molécula e interferometria multifásico, chamada interferometria fotoativado Localization Microscopy (iPALM). Este método oferece resolução quase isotrópica naordem de 20 nm em todas as três dimensões. Os protocolos para visualizar o citoesqueleto de actina filamentosa, incluindo a preparação da amostra e o funcionamento do instrumento iPALM, são descritos aqui. Estes protocolos são também prontamente adaptável e instrutiva para o estudo de outras características ultra-estruturais nas células.

Introduction

A visualização das estruturas celulares complexas, desde há muito integrante a insights biológicos e descoberta. Embora a microscopia de fluorescência pode células de imagem com especificidade molecular elevado, o seu poder de resolução é limitada por difracção para ~ 200 nm, no plano de imagem (x, y, ou dimensão lateral) e> 500 nm ao longo do eixo óptico (Z, ou dimensão axial) 1,2. Assim, a observação de características ultra-estruturais historicamente tem sido limitada a microscopia electrónica (ME). Felizmente, o recente desenvolvimento da microscopia de super-resolução tem contornado este limite, permitindo a resolução espacial no 10-100 gama nm 1-6. Em particular, super resolução abordagens baseadas em localização única molécula, conhecida por siglas como PALM (fotoativado Localization Microscopy) 4, FPALM (Fluorescência fotoativado Localization Microscopy) 5 (d) STORM (direto Stochastic Optical Reconstrução Microscopia) 6,7, PINTURA ( PoAcumulação int para imagens em nanoescala Topografia) 8, GSDIM (Estado Chão Depleção Microscopia seguido de retorno moleculares individuais) 9, ou SMACM (Single-molécula activa-Control Microscopia) 10, bem como as suas três dimensões implementações (3D), tal como PALM interferométrico (iPALM) 11 ou 3D-STORM 12, têm sido valiosos em revelar novos insights sobre a organização nanoescala de numerosas estruturas biológicas, incluindo os axônios neuronais e sinapses 13, adesões focais 14,15, junções célula-célula 16, nuclear poros 17 centrossomas, e 18-20, para nomear alguns.

Outra característica ultra-estruturais em células para as quais a microscopia de super-resolução é potencialmente útil é o citoesqueleto de actina. O complexo de malha filamentosa (F) -actina no córtex celular desempenha um papel essencial no controlo da forma e propriedades mecânicas celular 21. A organização of f-actina é activa e dinâmica regulada embora numerosas proteínas reguladoras que influenciam fortemente a polimerização, reticulação, volume de negócios, estabilidade e topologia de rede 22. No entanto, embora a caracterização da arquitectura malha de actina F é importante para percepções mecanísticos em uma grande variedade de processos celulares, o pequeno tamanho (~ 8 nm) dos filamentos F-actina dificulta a sua observação por microscopia de luz limitado por difração convencional; Assim, a visualização da estrutura fina actina tem sido até agora exclusivamente realizada por EM. Aqui, nós descrevemos protocolos para a visualização do citoesqueleto de actina F em células de mamífero aderentes, usando a técnica de microscopia de super-resolução iPALM para tirar partido da sua capacidade muito alta precisão em 3D 11,23. Embora o instrumento iPALM é altamente especializada, instruções sobre a criação de um tal instrumento foi descrito recentemente 23, enquanto o acesso ao microscópio iPALM organizada pelo Hoala Hughes Medical Institute, também foi disponibilizado para a comunidade científica com um custo mínimo. Além disso, os métodos de preparação de amostras aqui descritas são directamente aplicáveis aos abordagens alternativas 3D Super resolução, como aquelas baseadas em desfocagem astigmatic da função de propagação do ponto (PSF) de 12 ou bi-plano de detecção 24, que são mais amplamente disponível.

Notamos que um ingrediente necessário para a microscopia de super resolução baseada em localização única molécula, em geral, é o fluoróforo foto induzida 25, que permite que os três requisitos essenciais para a microscopia de super-resolução com base em localização única molécula de ser cumprido: i) alta single-molécula brilho e contraste em relação a sinais de fundo; ii) distribuição esparsa de moléculas individuais em um determinado quadro de imagem; e iii) densidade espacial de alta rotulagem suficiente para capturar o perfil da estrutura de base (também conhecida como Nyquist-Shacritério de amostragem nArquivos não) 26. Assim, para obter resultados satisfatórios, a ênfase deve ser colocada igualmente em ambos a preparação adequada das amostras para otimizar fluoróforo photoswitching e preservar a ultra-estrutura subjacente, bem como sobre os aspectos de instrumentação e aquisição dos experimentos.

Protocol

1. Criação de Imagens Preparação de Amostras Uma vez que os sinais de fluorescência de fundo interferir com fluorescência a partir de fluoróforos etiquetas, limpar os esfregaços por primeiro enxaguar em água desionizada (ddH2O) e, em seguida, ar-secando-os com ar comprimido. Subsequentemente, executar gravação por plasma num dispositivo de limpeza de plasma durante 15 seg, ou mais longo, se necessário. Para ativar a correção de deriva e calibração iPALM, utilize # 1.5 roun…

Representative Results

requisitos críticos para iPALM são o alinhamento, registro e calibração dos sistemas ópticos. Estes são necessários para garantir a interferência adequada dentro do 3-way divisor de feixe requisito para extração coordenada z. Para permitir a monitorização contínua, fontes pontuais constantes de fluorescência são necessárias. Isto pode ser conseguido usando fluorescente Au ou nanopartículas bimetálicas 23 cuja fotoluminescência surgir de ressonância de plasm…

Discussion

O sistema óptico de iPALM baseia-se no objectivo de criação de uma dupla-4-oposição π, como mostrado na Figura 1A. A configuração é construído usando peças tanto custom-usinados e comerciais opto-mecânico, como descrito anteriormente 23 e listados na Tabela 1. Além da nossa configuração, o Howard Hughes Medical Institute (HHMI) hospeda um sistema que é acessível à comunidade científica no Imaging Center avançada no Campus Janelia Research….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

YW e PK agradecem apoio financeiro da Fundação de Pesquisa Nacional de Cingapura, atribuído a PK (NRF-NRFF-2011-04 e NRF2012NRF-CRP001-084). Agradecemos também aos abertas de laboratório e de núcleo de microscopia instalações MBI para suporte de infraestrutura.

Materials

optical table Newport, CA  RS4000 iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators 
vibration isolator for optical table Newport, CA  S-2000 
laser-642 Newport, CA  1185055 output power=100mw
laser-561 Newport, CA  1168931 output power=200mw
laser-488 Newport, CA  1137970 output power=200mw
laser-405 Newport, CA  1142279 output power=100mw
broadband dielectric mirrors  Thorlabs, NJ BB1-E02 laser combiner
dichroic beamsplitter  Semrock, NY LM01-427-25
acousto-optic tunable filter  AA Opto-Electronic, France AOTFnC-VIS-TN
Linear polarizer Newport, CA  05LP-VIS-B
baseplate local workshop customized
turning mirror (22.5°) Reynard Corpporation, CA customized 22.5° mirror
motorized optic mounts  New Focus, CA 8816
motorized XYZ translation stage Thorlabs, NJ MT3/M-Z6 sample holder
T-Cube DC servo motor controller Thorlabs, NJ TDC001
Piezo Phase Shifter Physik Instrumente, Germany S-303.CD
objective lens Nikon, Japan MRD01691 objective. Apo TIRF 60X/1.49oil
translation stage New Focus, CA 9062-COM-M
Pico Motor Actuator New Focus, CA 8301
rotary Solenoid/Shutter DACO Instruments, CT 5423-458
3-way beam splitter Rocky Mountain Instruments, CO customized beamsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scanner Physik Instrumente, Germany S-316.10
motorized five-axis tilt aligner  New Focus, CA 8081
Picmotor ethernet controller New Focus, CA 8752
Piezo controllers/amplifier/digital operation module Physik Instrumente, Germany E-509/E-503/E-517
band-pass filter Semrock, NY FF01-523/20 filters
band-pass filter Semrock, NY FF01-588/21
band-pass filter Semrock, NY FF01-607/30
band-pass filter Semrock, NY FF01-676/37
notch filter Semrock, NY NF01-405/488/561/635
motorized filter wheel with controllter Thorlabs, NJ FW103H
EMCCD Andor, UK  DU-897U-CSO-#BV 3 sets
Desktop computers for controlling cameras and synchronization Dell Precision T3500 PC, 4 sets
coverslips with fiducial Hestzig, VA 600-100AuF sample preparation. fiducial marks with various density and spectra  available
fibronectin  Millipore, MT FC010
paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, PA 15710 fixation. 16%
glutaraldehyde  Electron Microscopy Sciences, PA 16220 25%
triton X-100 Sigma aldrich, MO T8787
HUVEC cells Life Technologies, CA C-015-10C
Medium 200 Life Technologies, CA M-200-500
Large Vessel Endothelial Factors Life Technologies, CA A14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 14190367
Pennicillin/Streptomycin 15140122
Trypsin/EDTA Life Technologies, CA 25200056
PIPES Sigma aldrich, MO P1851 PHEM
HEPES 1st base, Malaysia BIO-1825
EGTA Sigma aldrich, MO E3889
MgCl2 Millipore, MT 5985
 Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen, CA A22287 staining
sodium borohydride (NaBH4)  Sigma aldrich, MO 480886 quenching
glucose 1st base, Malaysia BIO-1101 imaging buffer
glucose oxidase Sigma aldrich, MO G2133
catalase Sigma aldrich, MO C9322
cysteamine  Sigma aldrich, MO 30070
Epoxy Thorlabs, NJ G14250
vaseline Sigma aldrich, MO 16415 sample sealing
lanolin Sigma aldrich, MO L7387
parafin wax Sigma aldrich, MO 327204
Immersion oil  Electron Microscopy Sciences, PA 16915-04 imaging. Cargille Type HF
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References

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Wang, Y., Kanchanawong, P. Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). J. Vis. Exp. (118), e54774, doi:10.3791/54774 (2016).
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