Tridimensionale Super Resolution Microscopia di filamenti di F-actina da interferometrico fotoattivati localizzazione Microscopy (iPALM)
Summary
Presentiamo un protocollo di applicazione del interferometrica fotoattivati localizzazione Microscopy (iPALM), un metodo di risoluzione di microscopia eccellente 3-dimensional localizzazione singola molecola, per l'imaging del citoscheletro actina in cellule di mammifero aderenti. Questo approccio permette la visualizzazione basata sulla luce delle caratteristiche strutturali nanoscala che altrimenti rimarrebbero irrisolti da convenzionale microscopia ottica di diffrazione limitata.
Abstract
Microscopia a fluorescenza permette la visualizzazione diretta di biomolecole specifici all'interno delle cellule. Tuttavia, per microscopia a fluorescenza convenzionale, la risoluzione spaziale è limitata dalla diffrazione a ~ 200 nm entro il piano dell'immagine e> 500 nm lungo l'asse ottico. Come risultato, la microscopia a fluorescenza è stata a lungo fortemente limitato nell'osservazione delle caratteristiche ultrastrutturali all'interno delle cellule. Il recente sviluppo di metodi di microscopia Super Resolution ha superato questa limitazione. In particolare, l'avvento di fluorofori photoswitchable permette al microscopio di risoluzione super di localizzazione basati, che fornisce potere di risoluzione si avvicina alla scala molecolare di lunghezza. Qui, descriviamo l'applicazione di un metodo di risoluzione di microscopia eccellente tridimensionale sulla base di singola molecola di localizzazione, microscopia ed interferometria multifase, chiamato interferometrica fotoattivati localizzazione Microscopy (iPALM). Questo metodo fornisce una risoluzione quasi isotropa sulladell'ordine di 20 nm nelle tre dimensioni. Protocolli per la visualizzazione del citoscheletro actina filamentosa, compresa la preparazione del campione e il funzionamento dello strumento iPALM, sono descritte qui. Questi protocolli sono facilmente adattabili e istruttivo per lo studio di altre caratteristiche ultrastrutturali nelle cellule.
Introduction
La visualizzazione delle strutture cellulari complesse è stata a lungo parte integrante di dati biologici e la scoperta. Sebbene microscopia a fluorescenza può celle di immagine con alta specificità molecolare, il suo potere di risoluzione è limitata dalla diffrazione a ~ 200 nm nel piano immagine (x, y, o dimensione laterale) e> 500 nm lungo l'asse ottico (z, o dimensione assiale) 1,2. Pertanto, l'osservazione delle caratteristiche ultrastrutturali è stato storicamente limitato a microscopia elettronica (EM). Fortunatamente, il recente sviluppo della microscopia super-risoluzione ha aggirato questo limite, consentendo la risoluzione spaziale nel 10-100 nm gamma 1-6. In particolare, super risoluzione approcci basati sulla localizzazione singola molecola, nota con acronimi quali PALM (fotoattivati localizzazione Microscopy) 4, FPALM (Fluorescence fotoattivati localizzazione Microscopy) 5 (d) STORM (diretta Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) 6,7, VERNICE ( Point accumulo per l'imaging Nanoscale Topografia) 8, GSDIM (giardino Stato Depletion Microscopia seguito dal ritorno molecolare individuale) 9, o SMACM (Single-molecola attiva-Control Microscopy) 10, così come le loro implementazioni in 3 dimensioni (3D), come ad esempio PALM interferometrica (iPALM) 11 o 3D-STORM 12, sono stati preziosi nel rivelare nuove intuizioni l'organizzazione su scala nanometrica di numerose strutture biologiche, tra cui gli assoni e sinapsi neuronali 13, adesioni focali 14,15, giunzioni cellula-cellula 16, pori nucleari 17 e centrosomi 18-20, solo per citarne alcuni.
Un'altra caratteristica ultrastrutturale nelle cellule per i quali la microscopia super-risoluzione è potenzialmente utile è il citoscheletro di actina. Il complesso reticolo di filamentosa (f) actina nella corteccia cellulare gioca un ruolo fondamentale nel controllo della forma cellulare e le proprietà meccaniche 21. L'organizzazione of f-actina è attivamente e dinamicamente regolata anche se numerose proteine regolatrici che influenzano fortemente la polimerizzazione, reticolazione, il fatturato, la stabilità e la topologia di rete 22. Tuttavia, anche se la caratterizzazione dell'architettura trabecolato f-actina è importante per intuizioni meccanicistici in una vasta gamma di processi cellulari, le piccole dimensioni (~ 8 nm) dei filamenti F-actina ostacola la loro osservazione convenzionale microscopia ottica diffrazione limitata; in tal modo, la visualizzazione di struttura fine actina è finora stata eseguita esclusivamente da EM. Qui, descriviamo i protocolli per la visualizzazione del citoscheletro F-actina in cellule di mammifero aderenti, utilizzando la tecnica di microscopia super-risoluzione iPALM per sfruttare la sua capacità di altissima precisione in 3D 11,23. Anche se lo strumento iPALM è altamente specializzato, istruzioni sulla creazione di un tale strumento è stato descritto di recente 23, mentre l'accesso al microscopio iPALM ospitato dalla Horeparto Hughes Medical Institute è stato messo a disposizione della comunità di ricerca con un costo minimo. Inoltre, i metodi di preparazione dei campioni descritti sono direttamente applicabili agli approcci alternativi 3D Super Resolution, come quelli basati su defocalizzazione astigmatica della funzione di diffusione di punto (PSF) 12 o bi-piano di rivelazione 24, che sono più ampiamente disponibili.
Notiamo che un ingrediente necessario per basati su localizzazione singola molecola di microscopia super-risoluzione, in generale, è il fluoroforo photoswitchable 25, che permette i tre requisiti fondamentali per la microscopia di risoluzione super-based localizzazione singola molecola per essere soddisfatti: i) ad alta singola molecola luminosità e contrasto rispetto a segnali di fondo; ii) la distribuzione sparsa di singole molecole in un determinato lasso di immagine; e iii) ad alta densità spaziale di etichettatura sufficiente per catturare il profilo della struttura sottostante (noto anche come Nyquist-Shacriterio di campionamento nnon) 26. Così, per ottenere risultati soddisfacenti, enfasi dovrebbe essere posta ugualmente sia la corretta preparazione dei campioni per ottimizzare fluoroforo photoswitching e per garantire la ultrastruttura sottostante, nonché sugli aspetti strumentazione e acquisizione degli esperimenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema ottico di iPALM si basa su un disegno obiettivo 4 π dual-opposti, come illustrato nella Figura 1A. La configurazione è costruito utilizzando parti sia custom-lavorati e commerciali opto-meccanici, come descritto in precedenza 23 ed elencati nella tabella 1. In aggiunta al nostro setup, l'Howard Hughes Medical Institute (HHMI) ospita un sistema che è accessibile alla comunità scientifica presso l'Advanced Imaging Center presso il Campus …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YW e PK ringraziano sostegno finanziario della Fondazione Nazionale delle Ricerche di Singapore, assegnato a PK (NRF-NRFF-2011-04 e NRF2012NRF-CRP001-084). Ringraziamo anche il laboratorio e il nucleo di microscopia aperte strutture MBI per il supporto delle infrastrutture.
Materials
| optical table | Newport, CA | RS4000 | iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators |
| vibration isolator for optical table | Newport, CA | S-2000 | |
| laser-642 | Newport, CA | 1185055 | output power=100mw |
| laser-561 | Newport, CA | 1168931 | output power=200mw |
| laser-488 | Newport, CA | 1137970 | output power=200mw |
| laser-405 | Newport, CA | 1142279 | output power=100mw |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, NJ | BB1-E02 | laser combiner |
| dichroic beamsplitter | Semrock, NY | LM01-427-25 | |
| acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic, France | AOTFnC-VIS-TN | |
| Linear polarizer | Newport, CA | 05LP-VIS-B | |
| baseplate | local workshop | customized | |
| turning mirror (22.5°) | Reynard Corpporation, CA | customized | 22.5° mirror |
| motorized optic mounts | New Focus, CA | 8816 | |
| motorized XYZ translation stage | Thorlabs, NJ | MT3/M-Z6 | sample holder |
| T-Cube DC servo motor controller | Thorlabs, NJ | TDC001 | |
| Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente, Germany | S-303.CD | |
| objective lens | Nikon, Japan | MRD01691 | objective. Apo TIRF 60X/1.49oil |
| translation stage | New Focus, CA | 9062-COM-M | |
| Pico Motor Actuator | New Focus, CA | 8301 | |
| rotary Solenoid/Shutter | DACO Instruments, CT | 5423-458 | |
| 3-way beam splitter | Rocky Mountain Instruments, CO | customized | beamsplitter |
| Piezo Z/Tip/Tilt scanner | Physik Instrumente, Germany | S-316.10 | |
| motorized five-axis tilt aligner | New Focus, CA | 8081 | |
| Picmotor ethernet controller | New Focus, CA | 8752 | |
| Piezo controllers/amplifier/digital operation module | Physik Instrumente, Germany | E-509/E-503/E-517 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-523/20 | filters |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-588/21 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-607/30 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-676/37 | |
| notch filter | Semrock, NY | NF01-405/488/561/635 | |
| motorized filter wheel with controllter | Thorlabs, NJ | FW103H | |
| EMCCD | Andor, UK | DU-897U-CSO-#BV | 3 sets |
| Desktop computers for controlling cameras and synchronization | Dell | Precision T3500 | PC, 4 sets |
| coverslips with fiducial | Hestzig, VA | 600-100AuF | sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available |
| fibronectin | Millipore, MT | FC010 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 15710 | fixation. 16% |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 16220 | 25% |
| triton X-100 | Sigma aldrich, MO | T8787 | |
| HUVEC cells | Life Technologies, CA | C-015-10C | |
| Medium 200 | Life Technologies, CA | M-200-500 | |
| Large Vessel Endothelial Factors | Life Technologies, CA | A14608-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
| Pennicillin/Streptomycin | 15140122 | ||
| Trypsin/EDTA | Life Technologies, CA | 25200056 | |
| PIPES | Sigma aldrich, MO | P1851 | PHEM |
| HEPES | 1st base, Malaysia | BIO-1825 | |
| EGTA | Sigma aldrich, MO | E3889 | |
| MgCl2 | Millipore, MT | 5985 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen, CA | A22287 | staining |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma aldrich, MO | 480886 | quenching |
| glucose | 1st base, Malaysia | BIO-1101 | imaging buffer |
| glucose oxidase | Sigma aldrich, MO | G2133 | |
| catalase | Sigma aldrich, MO | C9322 | |
| cysteamine | Sigma aldrich, MO | 30070 | |
| Epoxy | Thorlabs, NJ | G14250 | |
| vaseline | Sigma aldrich, MO | 16415 | sample sealing |
| lanolin | Sigma aldrich, MO | L7387 | |
| parafin wax | Sigma aldrich, MO | 327204 | |
| Immersion oil | Electron Microscopy Sciences, PA | 16915-04 | imaging. Cargille Type HF |
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