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生物学

입체 슈퍼의 간섭 광 활성화 현지화 현미경으로 F-액틴 필라멘트의 해상도 현미경 (iPALM)

Published: December 01, 2016
doi:
10.3791/54774
,
1Department of Biology,South University of Science and Technology of China, Shenzhen, 2Mechanobiology Institute, Singapore, 3Department of Biomedical Engineering,National University of Singapore

Summary

우리는 접착 포유류 세포에서 액틴 세포 골격의 이미징에 간섭 광 활성화 지역화 현미경 (iPALM), 3 차원 단일 분자 지역화 초 해상 현미경 법의 적용 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 다른 기존의 회절 제한 광학 현미경으로 해결되지 않은 남아있을 것입니다 나노 구조적 특징의 빛 기반 시각화 할 수 있습니다.

Abstract

형광 현미경은 세포 내 특정 생체 분자를 직접 시각화 할 수 있습니다. 그러나, 종래의 형광 현미경, 공간 해상도는 광축을 따라 결상면과> 내지 500nm에서 ~ 200 nm의 회절에 의해 제한된다. 결과적으로, 형광 현미경은 오랫동안 심각한 세포 내 미세 기능의 관찰에 한정되었다. 초 해상 현미경 방법의 최근 발전은 이러한 한계를 극복하고있다. 특히, 광전 환성 형광체의 출현 분자 길이 스케일에 접근 해상력을 제공하는 기반 지역화 초 해상 현미경을 가능하게한다. 여기서는 간섭계 광 활성화 지역화 현미경 (iPALM)이라는 단일 분자 파악 현미경 다상 간섭에 기초하여 입체 초 해상 현미경 법의 적용을 설명한다. 이 방법은에 거의 등방성 해상도를 제공세 가지 차원에서 20 나노 미터의 순서. iPALM 악기의 시료 준비 및 운영을 포함하여 사상 액틴 세포 골격을 시각화 프로토콜, 여기에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 세포에서 다른 미세 구조 기능 연구에 쉽게 적응과 교훈입니다.

Introduction

복잡한 세포 구조의 시각화는 오랫동안 생물 통찰력과 발견을 통합하고있다. 형광 현미경은, 그 해상력이 ~ 200 화상면에 나노 (X, Y, 또는 측 방향 치수) 및> 500 nm의 광학 축 방향 (Z, 또는 축 방향 치수)에 회절 고분자 특이성 화상 세포 제한 할 수 있지만 1, 2. 따라서, 미세 기능 관찰 역사적 전자 현미경 (EM)로 제한되어왔다. 100 nm의 범위 1-6 – 다행히, 슈퍼 해상도 현미경의 최근 발전은 10에서 공간 해상도를 가능하게,이 제한을 회피했다. 특히, 슈퍼 해상도는 같은 PALM (광 활성화 현지화 현미경) 4, FPALM은 (형광 광 활성화 현지화 현미경) 5 (d)에 STORM (직접 확률 광학 재건 현미경) 6, 7, PAINT (같은 약어로 알려진 단일 분자 현지화에 기반 접근 방법 포이미징 나노 지형) 8 INT의 축적은, GSDIM (접지 상태 고갈 현미경 9) 개별 분자 반환 한 다음, 또는 SMACM (단일 분자 액티브 제어 현미경) (10),뿐만 아니라 그들의 3 차원 (3D) 구현, 간섭 PALM (iPALM) 11 3D-STORM (12)는 신경 세포의 축삭을, 다수의 생물학적 구조의 나노 조직에 새로운 통찰력을 드러내는 포함 귀중한되었습니다 및 초점 유착 14, 15, 세포 – 세포 접합 (16), 원자력이 17 모공, 13 시냅스 및 중심체 18 ~ 20 등이 있습니다.

슈퍼 해상도 현미경은 잠재적으로 유용하는 세포의 또 다른 미세 기능은 액틴 세포 골격이다. 셀 피질 필라멘트 (F) 액틴의 복잡한 그물 세공은 세포 형태 및 기계적 특성 (21)의 제어에 중요한 역할을한다. 조직 오F의 F-액틴 적극적 동적 강하게 중합, 가교, 회전율, 안정성 및 네트워크 토폴로지 (22)에 영향을 미치는 수많은 조절 단백질 비록 조절된다. 그러나, F – 굴지 그물 세공 구조의 특성은 세포 과정의 다양한 범위, 기존의 회절 제한 광학 현미경으로 자신의 관찰을 방해은 F-액틴 필라멘트의 작은 크기 (~ 8 ㎚)에 기계적인 통찰력에 대한 중요하지만, 따라서 액틴 미세 구조의 시각화 종래 독점적 EM에 의해 수행되었다. 여기서는, 접착 포유류 세포에서 액틴 세포 골격 F-시각화 3D 11,23에 매우 높은 정밀도 기능을 활용할 iPALM 초 해상 현미경 기술을 사용하는 프로토콜을 기술한다. iPALM 악기는 매우 전문 있지만, 이러한 장비를 설정하는 방법에 대한 지시는 최근 23 설명되어있는 호 주최 iPALM 현미경에 액세스하는 동안구 휴즈 의학 연구소는 또한 최소의 비용으로 연구 커뮤니티에 제공하고있다. 또한, 본원에 기재된 시료 제조 방법은 더 광범위하게 사용할 수있는 등의 점 확산 함수 (PSF)의 난시 디 포커싱 기반으로하는 다른 3D 슈퍼 해상도 방법, (12) 또는 이중면 검출부 (24)에 직접적으로 적용될 수있다.

우리는 일반적으로 단일 분자 현지화 기반의 초 고해상도 현미경을위한 필요한 성분이 충족되어야 단일 분자 현지화 기반의 초 고해상도 현미경을위한 세 가지 핵심 요구 사항을 수있는 광전 환성 형광 25이므로주의 : ⅰ) 높은 단일 분자 배경 신호의 밝기 및 대비 상대; ⅱ) 소정의 이미지 프레임 내의 단일 분자의 희박한 분포; 또한 나이 퀴 스트 – 샤로 알려진 기본 구조 (의 프로필을 캡처하기에 충분한 라벨 및 ⅲ) 높은 공간 밀도nnon 샘플링 기준) 26. 따라서, 만족스러운 결과를 위해, 형광체의 강조 photoswitching을 최적화하고 기본 미세 구조를 보존 할뿐만 아니라, 실험 기기 및 수집 측면하는 시험편의 적절한 준비를 모두 동등하게 배치되어야한다.

Protocol

1. 이미징 표본 준비 배경 형광 신호는 형광 라벨 형광을 방해하기 때문에, 제 (DDH 2 O) 탈 이온수로 세정을 한 후, 압축 공기를 사용하여 공기 건조하여 coverglasses 청소. 그 후, 15 초 동안 플라즈마 클리너에 플라즈마 에칭을 수행하거나, 필요 이상. 드리프트 보정 및 iPALM 보정을 사용하려면, # 1.5 라운드 (22-mm 직경) 신뢰할 수있는 교정 및 드리프트 보정과 같은 높은 광 안정성…

Representative Results

iPALM 중요 요건은 광학 시스템의 정렬, 등록 및 교정된다. 추출 Z 좌표에 대한 이들 3 방향 빔 스플리터 내에서 필요한 적절한 간섭을 보장하기 위해 필요하다. 지속적인 모니터링을 사용하려면, 형광의 일정 지점 소스가 필요합니다. 이것은 형광 금 또는 그 포토 루미 국소 표면 플라즈몬 공명 (LSPR)에서 발생하는 이중 금속 나노 입자 (23)를 사용하여 달성 될 수?…

Discussion

도 1a에 도시 된 바와 같이 iPALM의 광학계는, 4 π 이중 대향 대물 설계에 기초한다. 표 1에 이전 (23) 설명 및 나열된 설정은 사용자 정의 가공 및 상업 모두 광학 기계 부품을 사용하여 구성된다. 우리의 설치뿐만 아니라, 하워드 휴즈 의학 연구소 (HHMI)는 Janelia 연구 캠퍼스에서 고급 이미지 센터에서 과학계에 액세스 할 수있는 시스템을 호스팅합니다. ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

YW 및 PK는 감사 PK (NRF-NRFF-2011-04 및 NRF2012NRF-CRP001-084)에게 수여 싱가포르 국립 연구 재단에서 자금 지원을 인정합니다. 우리는 또한 인프라 지원을위한 MBI 개방 실험실과 현미경의 핵심 시설을 주셔서 감사합니다.

Materials

optical table Newport, CA  RS4000 iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators 
vibration isolator for optical table Newport, CA  S-2000 
laser-642 Newport, CA  1185055 output power=100mw
laser-561 Newport, CA  1168931 output power=200mw
laser-488 Newport, CA  1137970 output power=200mw
laser-405 Newport, CA  1142279 output power=100mw
broadband dielectric mirrors  Thorlabs, NJ BB1-E02 laser combiner
dichroic beamsplitter  Semrock, NY LM01-427-25
acousto-optic tunable filter  AA Opto-Electronic, France AOTFnC-VIS-TN
Linear polarizer Newport, CA  05LP-VIS-B
baseplate local workshop customized
turning mirror (22.5°) Reynard Corpporation, CA customized 22.5° mirror
motorized optic mounts  New Focus, CA 8816
motorized XYZ translation stage Thorlabs, NJ MT3/M-Z6 sample holder
T-Cube DC servo motor controller Thorlabs, NJ TDC001
Piezo Phase Shifter Physik Instrumente, Germany S-303.CD
objective lens Nikon, Japan MRD01691 objective. Apo TIRF 60X/1.49oil
translation stage New Focus, CA 9062-COM-M
Pico Motor Actuator New Focus, CA 8301
rotary Solenoid/Shutter DACO Instruments, CT 5423-458
3-way beam splitter Rocky Mountain Instruments, CO customized beamsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scanner Physik Instrumente, Germany S-316.10
motorized five-axis tilt aligner  New Focus, CA 8081
Picmotor ethernet controller New Focus, CA 8752
Piezo controllers/amplifier/digital operation module Physik Instrumente, Germany E-509/E-503/E-517
band-pass filter Semrock, NY FF01-523/20 filters
band-pass filter Semrock, NY FF01-588/21
band-pass filter Semrock, NY FF01-607/30
band-pass filter Semrock, NY FF01-676/37
notch filter Semrock, NY NF01-405/488/561/635
motorized filter wheel with controllter Thorlabs, NJ FW103H
EMCCD Andor, UK  DU-897U-CSO-#BV 3 sets
Desktop computers for controlling cameras and synchronization Dell Precision T3500 PC, 4 sets
coverslips with fiducial Hestzig, VA 600-100AuF sample preparation. fiducial marks with various density and spectra  available
fibronectin  Millipore, MT FC010
paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, PA 15710 fixation. 16%
glutaraldehyde  Electron Microscopy Sciences, PA 16220 25%
triton X-100 Sigma aldrich, MO T8787
HUVEC cells Life Technologies, CA C-015-10C
Medium 200 Life Technologies, CA M-200-500
Large Vessel Endothelial Factors Life Technologies, CA A14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 14190367
Pennicillin/Streptomycin 15140122
Trypsin/EDTA Life Technologies, CA 25200056
PIPES Sigma aldrich, MO P1851 PHEM
HEPES 1st base, Malaysia BIO-1825
EGTA Sigma aldrich, MO E3889
MgCl2 Millipore, MT 5985
 Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen, CA A22287 staining
sodium borohydride (NaBH4)  Sigma aldrich, MO 480886 quenching
glucose 1st base, Malaysia BIO-1101 imaging buffer
glucose oxidase Sigma aldrich, MO G2133
catalase Sigma aldrich, MO C9322
cysteamine  Sigma aldrich, MO 30070
Epoxy Thorlabs, NJ G14250
vaseline Sigma aldrich, MO 16415 sample sealing
lanolin Sigma aldrich, MO L7387
parafin wax Sigma aldrich, MO 327204
Immersion oil  Electron Microscopy Sciences, PA 16915-04 imaging. Cargille Type HF
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References

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Wang, Y., Kanchanawong, P. Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). J. Vis. Exp. (118), e54774, doi:10.3791/54774 (2016).
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