Üç boyutlu Süper İnterferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi F-aktin Filament Çözünürlük Mikroskobu (iPALM)
Summary
Biz yapışık memeli hücrelerinde aktin hücre iskeletinin görüntüleme, interferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi (iPALM), 3-boyutlu tek-molekül yerelleştirme süper çözünürlük mikroskopi yöntemi uygulaması için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım, aksi takdirde geleneksel kırınım sınırlı optik mikroskopi ile çözülmemiş kalacağını nano yapısal özellikleri ışık tabanlı görselleştirme sağlar.
Abstract
Floresan mikroskopi hücreleri içinde belirli biyomoleküllerin doğrudan görüntülenmesine olanak tanıyan. Bununla birlikte, geleneksel floresan mikroskobu için, uzamsal çözünürlük optik eksen boyunca görüntü düzleminde ve> 500 nm olan ~ 200 nm ila kırınımı ile sınırlıdır. Bunun bir sonucu olarak, floresan mikroskobu uzun ciddi hücre içinde ultrastrüktürel özellikler gözlem sınırlıdır. süper çözünürlüklü mikroskopi yöntemleri son gelişmeler bu sınırlamanın üstesinden gelmiştir. Özellikle, photoswitchable fluorophores gelişi moleküler uzunlukta ölçeği yaklaşan çözme gücü sağlar yerelleştirme tabanlı süper çözünürlük mikroskopi, sağlar. Burada, interferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskobu (iPALM) olarak adlandırılan tek-molekül yerelleştirme mikroskopi ve çok fazlı interferometriye dayalı üç boyutlu süper çözünürlük mikroskopi yöntemi uygulanmasını açıklar. Bu yöntem neredeyse izotropik çözünürlük sağlarher üç boyutta da 20 nm sırası. iPALM aletin numune hazırlama ve işlemler dahil, ipliksi aktin hücre iskeleti görselleştirmek için protokoller, burada açıklanmıştır. Bu protokoller de hücrelerde diğer ultrastrüktürel özellikleri çalışma için kolaylıkla adapte ve öğreticidir.
Introduction
kompleks hücresel yapıların görselleştirme uzun biyolojik anlayışlar ve keşif ayrılmaz olmuştur. floresan mikroskopi, onun çözme gücü ~ 200 resim düzleminde nm (x, y, veya lateral boyut) ve> 500 nm optik eksen boyunca (z, ya da eksenel boyut) kırınım yüksek moleküler özgüllük ile görüntü hücreleri sınırlı olsa da 1,2. Bu nedenle, ultrastrüktürel özellikleri gözlem tarihsel elektron mikroskobu (EM) ile sınırlı kalmıştır. 100 nm aralığında 1-6 – Neyse, süper çözünürlük mikroskopisi son gelişme 10 uzaysal çözünürlüğü sağlayan bu sınırı hile vardır. Özellikle, süper çözünürlük gibi PALM (photoactivated Yerelleştirme Mikroskobu) 4, FPALM (Floresan photoactivated Yerelleştirme Mikroskobu) 5 (d) STORM (doğrudan Stokastik Optik İmar Mikroskopi) 6,7, BOYA (as kısaltmaları tarafından bilinen tek bir molekül lokalizasyonu dayalı yaklaşımlar poGörüntüleme Nano Topografya) 8 için int Birikim, GSDIM (Ground Devlet tükenmesi Mikroskopi 9) bireysel moleküler dönüşü takiben, ya da SMACM (Tek Molekül Aktif Kontrol Mikroskopi) 10, yanı sıra bunların 3 boyutlu (3D) uygulamaları, interferometrik PALM (iPALM) 11 veya 3D-STORM 12, nöronal aksonlar, çok sayıda biyolojik yapıların nano örgüte yeni bakış açıları ortaya dahil olmak üzere değerli olmuştur ve fokal yapışıklıklar 14,15, hücre-hücre kavşak 16, nükleer 17 gözeneklerin, 13 sinapsların ve sentrozomlar 18-20, birkaç isim.
süper çözünürlüklü mikroskopi potansiyel olarak yararlı olduğu hücrelerde başka ultrastrüktürel özelliği aktin hücre iskeleti olduğunu. Hücre kortekste filamentli (f) aktin için kompleks ağ örgüsü hücre şekli ve mekanik özellikleri 21 kontrolünde önemli bir rol oynar. organizasyon of f-aktin aktif ve dinamik güçlü polimerizasyonu, çapraz bağlanmayı, ciro, istikrar ve ağ topolojisini 22 etkileyen çok sayıda düzenleyici proteinler olsa düzenlenir. Ancak, f-aktin ağ örgüsü mimarisinin karakterizasyonu hücresel süreçlerin çeşitli bir yelpazede, geleneksel kırınım sınırlı ışık mikroskobu ile kendi gözlemini engelleyen f-aktin filamentler küçük boyutlu (~ 8 nm) içine mekanistik anlayışlar için önemli olmasına rağmen; böylece, aktin ince yapısı görselleştirme, şimdiye kadar sadece EM ile yapılmaktadır. Burada, biz, yapışık memeli hücrelerinde f-aktin hücre iskeleti görselleştirmek 3D 11,23 yılında çok yüksek hassasiyetli yeteneği yararlanmak için iPALM süper çözünürlük mikroskopi tekniği kullanarak protokolleri açıklar. IPALM enstrüman son derece uzmanlaşmış olmasına rağmen, böyle bir araç kurma hakkında talimat, son zamanlarda 23 tarif edilmiştir Ho tarafından barındırılan iPALM mikroskop erişim sırasındakoğuş Hughes Tıp Enstitüsü de minimum maliyetle araştırma topluluğuna kullanılabilir hale getirilmiştir. Buna ek olarak, burada açıklanan numune hazırlama yöntemleri daha geniş mevcut gibi nokta dağılım fonksiyonu (PSF) ve astigmat odaktan uzaklaşma dayalı olanlar gibi alternatif 3D süper çözünürlük yaklaşımları, 12 veya bi-düzlem algılama 24, doğrudan uygulanabilir.
Biz genel olarak tek-molekül yerelleştirme tabanlı süper çözünürlük mikroskopi için gerekli bir maddedir yerine getirilmesi tek-molekül yerelleştirme tabanlı süper çözünürlük mikroskopi için üç kritik gereksinimleri izin veren photoswitchable fluorofor 25 olduğuna dikkat: i) yüksek tek-molekül arka plan sinyallerine parlaklık ve kontrast akraba; ii) Belirli bir resim çerçevesi içinde tek moleküllerin seyrek dağılımı; Ayrıca Nyquist-Sha olarak bilinen altta yatan yapının (profilini yakalamak için yeterli etiketleme ve iii) yüksek uzaysal yoğunluknnon örnekleme kriteri) 26. Bu nedenle, tatmin edici sonuçlar elde etmek için ağırlık florofor photoswitching optimize etmek ve altta yatan ultrastrüktürel korumak hem de deney cihazı ve alıcı yönleri için numunelerin uygun hazırlanması hem de eşit yerleştirilmelidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Şekil 1A 'de gösterildiği gibi iPALM optik sistemi, 4-π çift karşıt amaçlı tasarım dayanmaktadır. Tablo 1'de önceki 23 anlatıldığı ve listelenen kurulum, özel işlenmiş ve ticari opto-mekanik parçalar kullanılarak inşa edilmiştir. Bizim kurulumuna ek olarak, Howard Hughes Tıp Enstitüsü (HHMI) Janelia Araştırma Kampüsü'nde İleri Görüntüleme Merkezi bilim dünyası için erişilebilir bir sistem barındırır. Tam me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YW ve PK minnetle PK (NRF-NRFF-2011-04 ve NRF2012NRF-CRP001-084) verilir Singapur Ulusal Araştırma Vakfı, finansman desteği kabul. Biz de altyapı desteği için MTE açık laboratuvar ve mikroskopi çekirdek imkanları teşekkür ederim.
Materials
| optical table | Newport, CA | RS4000 | iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators |
| vibration isolator for optical table | Newport, CA | S-2000 | |
| laser-642 | Newport, CA | 1185055 | output power=100mw |
| laser-561 | Newport, CA | 1168931 | output power=200mw |
| laser-488 | Newport, CA | 1137970 | output power=200mw |
| laser-405 | Newport, CA | 1142279 | output power=100mw |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, NJ | BB1-E02 | laser combiner |
| dichroic beamsplitter | Semrock, NY | LM01-427-25 | |
| acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic, France | AOTFnC-VIS-TN | |
| Linear polarizer | Newport, CA | 05LP-VIS-B | |
| baseplate | local workshop | customized | |
| turning mirror (22.5°) | Reynard Corpporation, CA | customized | 22.5° mirror |
| motorized optic mounts | New Focus, CA | 8816 | |
| motorized XYZ translation stage | Thorlabs, NJ | MT3/M-Z6 | sample holder |
| T-Cube DC servo motor controller | Thorlabs, NJ | TDC001 | |
| Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente, Germany | S-303.CD | |
| objective lens | Nikon, Japan | MRD01691 | objective. Apo TIRF 60X/1.49oil |
| translation stage | New Focus, CA | 9062-COM-M | |
| Pico Motor Actuator | New Focus, CA | 8301 | |
| rotary Solenoid/Shutter | DACO Instruments, CT | 5423-458 | |
| 3-way beam splitter | Rocky Mountain Instruments, CO | customized | beamsplitter |
| Piezo Z/Tip/Tilt scanner | Physik Instrumente, Germany | S-316.10 | |
| motorized five-axis tilt aligner | New Focus, CA | 8081 | |
| Picmotor ethernet controller | New Focus, CA | 8752 | |
| Piezo controllers/amplifier/digital operation module | Physik Instrumente, Germany | E-509/E-503/E-517 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-523/20 | filters |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-588/21 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-607/30 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-676/37 | |
| notch filter | Semrock, NY | NF01-405/488/561/635 | |
| motorized filter wheel with controllter | Thorlabs, NJ | FW103H | |
| EMCCD | Andor, UK | DU-897U-CSO-#BV | 3 sets |
| Desktop computers for controlling cameras and synchronization | Dell | Precision T3500 | PC, 4 sets |
| coverslips with fiducial | Hestzig, VA | 600-100AuF | sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available |
| fibronectin | Millipore, MT | FC010 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 15710 | fixation. 16% |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 16220 | 25% |
| triton X-100 | Sigma aldrich, MO | T8787 | |
| HUVEC cells | Life Technologies, CA | C-015-10C | |
| Medium 200 | Life Technologies, CA | M-200-500 | |
| Large Vessel Endothelial Factors | Life Technologies, CA | A14608-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
| Pennicillin/Streptomycin | 15140122 | ||
| Trypsin/EDTA | Life Technologies, CA | 25200056 | |
| PIPES | Sigma aldrich, MO | P1851 | PHEM |
| HEPES | 1st base, Malaysia | BIO-1825 | |
| EGTA | Sigma aldrich, MO | E3889 | |
| MgCl2 | Millipore, MT | 5985 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen, CA | A22287 | staining |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma aldrich, MO | 480886 | quenching |
| glucose | 1st base, Malaysia | BIO-1101 | imaging buffer |
| glucose oxidase | Sigma aldrich, MO | G2133 | |
| catalase | Sigma aldrich, MO | C9322 | |
| cysteamine | Sigma aldrich, MO | 30070 | |
| Epoxy | Thorlabs, NJ | G14250 | |
| vaseline | Sigma aldrich, MO | 16415 | sample sealing |
| lanolin | Sigma aldrich, MO | L7387 | |
| parafin wax | Sigma aldrich, MO | 327204 | |
| Immersion oil | Electron Microscopy Sciences, PA | 16915-04 | imaging. Cargille Type HF |
References
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
- Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
- Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
- Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
- Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
- Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).
- Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
- Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).
- Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
- Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
- Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
- Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-492 (2010).
- Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).
- Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. 生物化学. 5, 467-477 (1966).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Shin, W. D., Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L., et al. . Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2010).
- Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
- Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. Visualization of Localization Microscopy Data. Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).
- El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
- Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
- Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
- Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
- Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
- Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279 (2011).
- Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).
