Dreidimensionale Super Resolution Mikroskopie von F-Aktin durch interferometrische fotoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm)
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll für die Anwendung von interferometrischen photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm), einer 3-dimensionalen Einzelmoleküllokalisierung Super Resolution Mikroskopie-Methode, um die Abbildung des Aktin-Zytoskelett in adhärenten Säugerzellen. Dieser Ansatz ermöglicht es Licht-basierte Visualisierung von Nanostrukturmerkmale, die sonst mit herkömmlichen beugungsbegrenzten optischen Mikroskopie ungelöst bleiben würde.
Abstract
Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die direkte Visualisierung von spezifischen Biomoleküle in Zellen. Jedoch für konventionelle Fluoreszenzmikroskopie, die räumliche Auflösung wird durch Beugung auf ~ 200 nm innerhalb der Bildebene und> 500 nm entlang der optischen Achse beschränkt. Als Ergebnis wurde bei der Beobachtung der ultrastrukturellen Merkmale innerhalb der Zellen Fluoreszenzmikroskopie lang stark eingeschränkt. Die jüngste Entwicklung der Super Resolution Mikroskopie-Methoden hat diese Einschränkung zu überwinden. Insbesondere ermöglicht das Aufkommen von photoschaltbarer Fluorophore Lokalisation-basierten Super Resolution Mikroskopie, die die molekulare Länge Annäherung Skala Auflösungsvermögen zur Verfügung stellt. Hier beschreiben wir die Anwendung eines dreidimensionalen Super Resolution Mikroskopie-Methode basiert auf Einzelmoleküllokalisierungsmikroskopie und mehrphasigen Interferometrie genannt interferometrischen photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm). Dieses Verfahren liefert nahezu isotrop Auflösung auf demGrößenordnung von 20 nm in allen drei Dimensionen. Protokolle für die filamentöse Aktin-Zytoskelett Visualisierung, einschließlich Probenvorbereitung und den Betrieb des Instruments iPalm, werden hier beschrieben. Diese Protokolle sind auch leicht anpaßbar und lehrreich für die Untersuchung anderer ultrastrukturelle Merkmale in Zellen.
Introduction
Die Visualisierung von komplexen zellulären Strukturen ist seit langem ein integraler Bestandteil biologische Einsichten und Entdeckungen. Obwohl die Fluoreszenzmikroskopie können Bildzellen mit hohem Molekular Spezifität, dessen Auflösungsvermögen durch Beugung auf ~ 200 nm in der Bildebene begrenzt ist (x, y, oder laterale Dimension) und> 500 nm entlang der optischen Achse (z, oder axiale Abmessung) 1,2. Daher hat die Beobachtung der ultrastrukturellen Merkmale historisch worden Elektronenmikroskopie (EM) begrenzt. Glücklicherweise hat die jüngste Entwicklung der Super Resolution Mikroskopie , diese Grenze zu umgehen, räumliche Auflösung im 10 ermöglicht – Bereich 100 nm 1-6. Insbesondere Ansätze Superauflösung auf Einzelmoleküllokalisierung anhand von Akronymen wie PALM (photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie) 4 bekannt, FPALM (Fluorescence photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie) 5 (d) STORM (direkte Stochastische Optische Rekonstruktionsmikroskopie) 6,7, PAINT ( Point Accumulation for Imaging Nanoskalige Topographie) 8, GSDIM (Grundzustand Depletion – Mikroskopie , gefolgt von einzelnen Molekülrück) 9 oder SMACM (Einzelmolekül – Aktiv-Control – Mikroskopie) 10, sowie deren 3-dimensionale (3D) Implementierungen, wie interferometrischen PALM (iPalm) 11 oder 3D-STORM 12, haben neuronale Axone in enthüllt neue Einblicke in die nanoskaligen Organisation zahlreicher biologischer Strukturen, einschließlich wertvoll und Synapsen 13, Fokaladhäsionen 14,15, Zell-Zell – Verbindungen 16, Kernporen 17 und Zentrosomen 18-20, um nur einige zu nennen.
Ein weiteres Merkmal ultra in Zellen, für die Super Resolution Mikroskopie potentiell nützlich ist, ist das Aktin-Zytoskelett. Der Komplex meshwork filamentöser (f) -Actin in der Zelle cortex spielt eine wesentliche Rolle bei der Kontrolle der Zellform und der mechanischen Eigenschaften 21. Die Organisation of F-Aktin ist aktiv und dynamisch wenn zahlreiche regulatorische Proteine reguliert , die stark beeinflussen Polymerisation, Vernetzung, Umsatz, Stabilität und Netzwerktopologie 22. Doch obwohl die Charakterisierung der f-Actin meshwork Architektur ist wichtig für die mechanistische Einblicke in ein breites Spektrum von zellulären Prozessen, die geringe Größe (~ 8 nm) der f-Aktin-Filamente ihre Beobachtung behindert durch konventionelle beugungsbegrenzte Lichtmikroskopie; Somit hat die Visualisierung von Aktin Feinstruktur bisher durch EM ausschließlich durchgeführt. Hier beschreiben wir Protokolle zur Visualisierung des f-Aktin – Zytoskelett in adhärenten Säugetierzellen unter Verwendung der iPalm Super Resolution Mikroskopie – Technik den Vorteil der sehr hohen Präzision Fähigkeit zu nehmen in 3D 11,23. Obwohl die iPalm Instrument hoch spezialisiert ist, Instruktion über die Einrichtung eines solchen Instruments wurde vor kurzem 23 beschrieben, während der Zugang zu dem iPalm Mikroskop vom Ho gehostetStation Hughes Medical Institute hat sich auch für die Forschungsgemeinschaft mit minimalen Kosten zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus sind die Probenvorbereitung hier beschriebenen Verfahren unmittelbar auf alternative 3D Super Resolution Ansätze, wie solche auf Basis von astigmatischen Defokussierung des Punktverteilungsfunktion (PSF) 12 oder bi-Ebenenerkennung 24, die im weiteren Sinne zur Verfügung stehen.
Wir stellen fest , dass ein notwendiger Bestandteil für Einzelmoleküllokalisierung-basierten Super Resolution Mikroskopie im Allgemeinen ist die photoschaltbare Fluorophore 25, die die drei kritischen Anforderungen für Einzelmoleküllokalisierung-basierten Super Resolution Mikroskopie erfüllt werden können: i) hohe Einzelmolekül Helligkeit und Kontrast in Bezug auf Hintergrundsignale; ii) spärliche Verteilung einzelner Moleküle in einem gegebenen Bildrahmen; und iii) eine hohe räumliche Dichte der Markierung ausreichend, um das Profil der darunterliegenden Struktur zu erfassen (auch bekannt als Nyquist-Shannon Sampling – Kriterium) 26. So für zufriedenstellende Ergebnisse sollte der Schwerpunkt gleichermaßen sowohl auf der richtigen Vorbereitung von Proben Fluorophor Photoschaltbarkeit platziert werden, um zu optimieren und die zugrunde liegende Ultrastruktur sowie auf die Instrumentierung und Akquisitions Aspekte der Experimente zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das optische System iPalm basiert auf einem 4-π dual-Gegensatz Ziel – Design, wie in 1A gezeigt. Die Einrichtung ist mit konstruiert sowohl individuell bearbeitet und kommerzielle opto-mechanische Teile, wie bereits 23 beschrieben und in Tabelle 1 aufgelistet. Zusätzlich zu unserer Einrichtung beherbergt das Howard Hughes Medical Institute (HHMI) ein System, das für die wissenschaftliche Gemeinschaft an der Advanced Imaging Center an der Janelia Research C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YW und PK dankbar finanzielle Unterstützung von der Singapore National Research Foundation, vergeben PK (NRF-NRFF-2011-04 und NRF2012NRF-CRP001-084) bestätigen. Wir danken auch den MBI offenen Labor und Mikroskopie Kerneinrichtungen für Infrastrukturunterstützung.
Materials
| optical table | Newport, CA | RS4000 | iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators |
| vibration isolator for optical table | Newport, CA | S-2000 | |
| laser-642 | Newport, CA | 1185055 | output power=100mw |
| laser-561 | Newport, CA | 1168931 | output power=200mw |
| laser-488 | Newport, CA | 1137970 | output power=200mw |
| laser-405 | Newport, CA | 1142279 | output power=100mw |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, NJ | BB1-E02 | laser combiner |
| dichroic beamsplitter | Semrock, NY | LM01-427-25 | |
| acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic, France | AOTFnC-VIS-TN | |
| Linear polarizer | Newport, CA | 05LP-VIS-B | |
| baseplate | local workshop | customized | |
| turning mirror (22.5°) | Reynard Corpporation, CA | customized | 22.5° mirror |
| motorized optic mounts | New Focus, CA | 8816 | |
| motorized XYZ translation stage | Thorlabs, NJ | MT3/M-Z6 | sample holder |
| T-Cube DC servo motor controller | Thorlabs, NJ | TDC001 | |
| Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente, Germany | S-303.CD | |
| objective lens | Nikon, Japan | MRD01691 | objective. Apo TIRF 60X/1.49oil |
| translation stage | New Focus, CA | 9062-COM-M | |
| Pico Motor Actuator | New Focus, CA | 8301 | |
| rotary Solenoid/Shutter | DACO Instruments, CT | 5423-458 | |
| 3-way beam splitter | Rocky Mountain Instruments, CO | customized | beamsplitter |
| Piezo Z/Tip/Tilt scanner | Physik Instrumente, Germany | S-316.10 | |
| motorized five-axis tilt aligner | New Focus, CA | 8081 | |
| Picmotor ethernet controller | New Focus, CA | 8752 | |
| Piezo controllers/amplifier/digital operation module | Physik Instrumente, Germany | E-509/E-503/E-517 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-523/20 | filters |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-588/21 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-607/30 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-676/37 | |
| notch filter | Semrock, NY | NF01-405/488/561/635 | |
| motorized filter wheel with controllter | Thorlabs, NJ | FW103H | |
| EMCCD | Andor, UK | DU-897U-CSO-#BV | 3 sets |
| Desktop computers for controlling cameras and synchronization | Dell | Precision T3500 | PC, 4 sets |
| coverslips with fiducial | Hestzig, VA | 600-100AuF | sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available |
| fibronectin | Millipore, MT | FC010 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 15710 | fixation. 16% |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 16220 | 25% |
| triton X-100 | Sigma aldrich, MO | T8787 | |
| HUVEC cells | Life Technologies, CA | C-015-10C | |
| Medium 200 | Life Technologies, CA | M-200-500 | |
| Large Vessel Endothelial Factors | Life Technologies, CA | A14608-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
| Pennicillin/Streptomycin | 15140122 | ||
| Trypsin/EDTA | Life Technologies, CA | 25200056 | |
| PIPES | Sigma aldrich, MO | P1851 | PHEM |
| HEPES | 1st base, Malaysia | BIO-1825 | |
| EGTA | Sigma aldrich, MO | E3889 | |
| MgCl2 | Millipore, MT | 5985 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen, CA | A22287 | staining |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma aldrich, MO | 480886 | quenching |
| glucose | 1st base, Malaysia | BIO-1101 | imaging buffer |
| glucose oxidase | Sigma aldrich, MO | G2133 | |
| catalase | Sigma aldrich, MO | C9322 | |
| cysteamine | Sigma aldrich, MO | 30070 | |
| Epoxy | Thorlabs, NJ | G14250 | |
| vaseline | Sigma aldrich, MO | 16415 | sample sealing |
| lanolin | Sigma aldrich, MO | L7387 | |
| parafin wax | Sigma aldrich, MO | 327204 | |
| Immersion oil | Electron Microscopy Sciences, PA | 16915-04 | imaging. Cargille Type HF |
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