Trois dimensions Super Resolution Microscopie de Filaments F-actine par interférométrique photoactive Localisation Microscopy (iPALM)
Summary
Nous présentons un protocole pour l'application de localisation interférométrique photoactive Microscopie (iPALM), une méthode nanoscope trois dimensions molécule unique de localisation, à l'imagerie du cytosquelette d'actine dans les cellules de mammifères adhérentes. Cette approche permet la visualisation à base de lumière des caractéristiques structurelles nanométriques qui autrement resteraient en suspens par microscopie optique à diffraction limitée classique.
Abstract
La microscopie à fluorescence permet la visualisation directe de biomolécules spécifiques dans les cellules. Cependant, pour la microscopie par fluorescence classique, la résolution spatiale est limitée par la diffraction à ~ 200 nm dans le plan d'image et> 500 nm le long de l'axe optique. Par conséquent, la microscopie par fluorescence a longtemps été sévèrement limité à l'observation des caractéristiques ultrastructurales dans les cellules. Le développement récent des méthodes de microscopie super-résolution a surmonté cette limitation. En particulier, l'avènement de fluorophores photoswitchable permet de super résolution microscopie à base de localisation, ce qui fournit un pouvoir de résolution approcher l'échelle moléculaire longueur. Ici, nous décrivons l'application d'une méthode ultra tridimensionnelle résolution microscopie basée sur une seule molécule microscopie localisation et interférométrie polyphasique, appelé interférométrique photoactive Localisation Microscopie (iPALM). Cette méthode offre une résolution quasi isotrope sur laordre de 20 nm dans les trois dimensions. Des protocoles pour la visualisation du cytosquelette d'actine filamenteuse, y compris la préparation des échantillons et le fonctionnement de l'instrument iPALM, sont décrits ici. Ces protocoles sont également facilement adaptable et instructif pour l'étude d'autres caractéristiques ultrastructurales dans les cellules.
Introduction
La visualisation des structures cellulaires complexes depuis longtemps partie intégrante de connaissances biologiques et de découverte. Bien que la microscopie de fluorescence peut imager des cellules ayant une spécificité moléculaire élevée, son pouvoir de résolution est limitée par la diffraction à ~ 200 nm dans le plan d'image (x, y ou dimension latérale), et> 500 nm le long de l'axe optique (z, ou dimension axiale) 1,2. Par conséquent, l'observation des caractéristiques ultrastructurales ont toujours été limitées à la microscopie électronique (EM). Heureusement, le développement récent de nanoscope a contourné cette limite, ce qui permet une résolution spatiale dans le 10 – gamme de 100 nm 1-6. En particulier, super résolution approches basées sur la localisation unique molécule, connue par des acronymes tels que PALM (photoactive Localisation Microscopy) 4, FPALM (Fluorescence photoactive Localisation Microscopy) 5 (d) STORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) 6,7, PAINT ( Point Accumulation for Imaging Nanoscale Topographie) 8, GSDIM (État sol Depletion Microscopie suivi par retour moléculaire individuel) 9, ou SMACM (Single-Molecule Active-contrôle Microscopy) 10, ainsi que leurs (3D) implémentations 3 dimensions, telles que PALM interférométrique (iPALM) 11 ou 3D-STORM 12, ont été précieux pour révéler de nouvelles perspectives dans l'organisation à l' échelle nanométrique de nombreuses structures biologiques, y compris les axones neuronaux et synapses 13, adhérences focales 14,15, jonctions cellule-cellule 16, les pores nucléaires 17 et centrosomes 18-20, pour ne citer que quelques – uns.
Une autre caractéristique ultrastructural dans les cellules pour lesquelles nanoscope est potentiellement utile est le cytosquelette d'actine. Le maillage complexe de filamenteuse (f) actine dans le cortex cellulaire joue un rôle essentiel dans le contrôle de la forme cellulaire et les propriétés mécaniques 21. L'organisation of f-actine est active et dynamique régulée si de nombreuses protéines régulatrices qui influencent fortement la polymérisation, la réticulation, le chiffre d' affaires, la stabilité et la topologie du réseau 22. Cependant, bien que la caractérisation de l'architecture meshwork f-actine est important pour des idées mécanistes dans un large éventail de processus cellulaires, la petite taille (~ 8 nm) des filaments f-actine entrave leur observation par microscopie optique conventionnelle limitée par la diffraction; ainsi, la visualisation de structure fine actine a jusqu'à présent été exclusivement réalisé par EM. Ici, nous décrivons les protocoles pour visualiser le cytosquelette d'actine F dans les cellules de mammifères adhérentes, en utilisant la technique de microscopie super résolution iPALM pour tirer parti de sa capacité de très haute précision en 3D 11,23. Bien que l'instrument iPALM est hautement spécialisée, des instructions sur la mise en place d' un tel instrument a été récemment décrit 23, alors que l' accès au microscope iPALM hébergé par le Hopupille Hughes Medical Institute a également été mis à la disposition de la communauté scientifique à un coût minime. En outre, les méthodes de préparation des échantillons décrits ici sont directement applicables à d' autres approches 3D super – résolution, tels que ceux basés sur défocalisation astigmate de la fonction d'étalement de point (PSF) 12 ou bi-plan de détection 24, qui sont plus largement disponibles.
Nous notons qu'un ingrédient nécessaire pour la microscopie de super – résolution basée sur la localisation unique de molécule en général est le fluorophore photoswitchable 25, qui permet aux trois exigences critiques pour la microscopie super – résolution basée sur la localisation unique de molécule à être remplies: i) élevé seule molécule luminosité et le contraste par rapport aux signaux d'arrière-plan; ii) la distribution clairsemée de molécules simples dans une trame d'image donnée; et iii) de haute densité spatiale d'étiquetage suffisant pour capturer le profil de la structure sous-jacente (également connue sous le nom de Nyquist-Shacritère d'échantillonnage nLes) 26. Ainsi, pour obtenir des résultats satisfaisants, l'accent doit être mis aussi à la fois sur la bonne préparation des échantillons pour optimiser fluorophore photocommutation et de préserver l'ultrastructure sous-jacent, ainsi que sur les instruments et d'acquisition aspects des expériences.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le système optique de iPALM est basé sur une conception à double objectif opposé 4-π, comme illustré sur la figure 1A. La configuration est construit en utilisant des pièces opto-mécaniques à la fois sur mesure usinées et commerciales, comme décrit plus haut 23 et énumérés dans le tableau 1. En plus de notre configuration, le Howard Hughes Medical Institute (HHMI) héberge un système qui est accessible à la communauté scientifique au Centre d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YW et PK remercient le soutien financier de la Fondation de recherche national de Singapour, décerné à PK (NRF-NRFF-2011-04 et NRF2012NRF-CRP001-084). Nous remercions également les laboratoires et de base de microscopie ouvertes installations MBI pour le soutien de l'infrastructure.
Materials
| optical table | Newport, CA | RS4000 | iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators |
| vibration isolator for optical table | Newport, CA | S-2000 | |
| laser-642 | Newport, CA | 1185055 | output power=100mw |
| laser-561 | Newport, CA | 1168931 | output power=200mw |
| laser-488 | Newport, CA | 1137970 | output power=200mw |
| laser-405 | Newport, CA | 1142279 | output power=100mw |
| broadband dielectric mirrors | Thorlabs, NJ | BB1-E02 | laser combiner |
| dichroic beamsplitter | Semrock, NY | LM01-427-25 | |
| acousto-optic tunable filter | AA Opto-Electronic, France | AOTFnC-VIS-TN | |
| Linear polarizer | Newport, CA | 05LP-VIS-B | |
| baseplate | local workshop | customized | |
| turning mirror (22.5°) | Reynard Corpporation, CA | customized | 22.5° mirror |
| motorized optic mounts | New Focus, CA | 8816 | |
| motorized XYZ translation stage | Thorlabs, NJ | MT3/M-Z6 | sample holder |
| T-Cube DC servo motor controller | Thorlabs, NJ | TDC001 | |
| Piezo Phase Shifter | Physik Instrumente, Germany | S-303.CD | |
| objective lens | Nikon, Japan | MRD01691 | objective. Apo TIRF 60X/1.49oil |
| translation stage | New Focus, CA | 9062-COM-M | |
| Pico Motor Actuator | New Focus, CA | 8301 | |
| rotary Solenoid/Shutter | DACO Instruments, CT | 5423-458 | |
| 3-way beam splitter | Rocky Mountain Instruments, CO | customized | beamsplitter |
| Piezo Z/Tip/Tilt scanner | Physik Instrumente, Germany | S-316.10 | |
| motorized five-axis tilt aligner | New Focus, CA | 8081 | |
| Picmotor ethernet controller | New Focus, CA | 8752 | |
| Piezo controllers/amplifier/digital operation module | Physik Instrumente, Germany | E-509/E-503/E-517 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-523/20 | filters |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-588/21 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-607/30 | |
| band-pass filter | Semrock, NY | FF01-676/37 | |
| notch filter | Semrock, NY | NF01-405/488/561/635 | |
| motorized filter wheel with controllter | Thorlabs, NJ | FW103H | |
| EMCCD | Andor, UK | DU-897U-CSO-#BV | 3 sets |
| Desktop computers for controlling cameras and synchronization | Dell | Precision T3500 | PC, 4 sets |
| coverslips with fiducial | Hestzig, VA | 600-100AuF | sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available |
| fibronectin | Millipore, MT | FC010 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 15710 | fixation. 16% |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences, PA | 16220 | 25% |
| triton X-100 | Sigma aldrich, MO | T8787 | |
| HUVEC cells | Life Technologies, CA | C-015-10C | |
| Medium 200 | Life Technologies, CA | M-200-500 | |
| Large Vessel Endothelial Factors | Life Technologies, CA | A14608-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | 14190367 | ||
| Pennicillin/Streptomycin | 15140122 | ||
| Trypsin/EDTA | Life Technologies, CA | 25200056 | |
| PIPES | Sigma aldrich, MO | P1851 | PHEM |
| HEPES | 1st base, Malaysia | BIO-1825 | |
| EGTA | Sigma aldrich, MO | E3889 | |
| MgCl2 | Millipore, MT | 5985 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen, CA | A22287 | staining |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma aldrich, MO | 480886 | quenching |
| glucose | 1st base, Malaysia | BIO-1101 | imaging buffer |
| glucose oxidase | Sigma aldrich, MO | G2133 | |
| catalase | Sigma aldrich, MO | C9322 | |
| cysteamine | Sigma aldrich, MO | 30070 | |
| Epoxy | Thorlabs, NJ | G14250 | |
| vaseline | Sigma aldrich, MO | 16415 | sample sealing |
| lanolin | Sigma aldrich, MO | L7387 | |
| parafin wax | Sigma aldrich, MO | 327204 | |
| Immersion oil | Electron Microscopy Sciences, PA | 16915-04 | imaging. Cargille Type HF |
References
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
- Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
- Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
- Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
- Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
- Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
- Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).
- Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
- Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).
- Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
- Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
- Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
- Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-492 (2010).
- Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).
- Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. 生物化学. 5, 467-477 (1966).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Shin, W. D., Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L., et al. . Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2010).
- Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
- Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. Visualization of Localization Microscopy Data. Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).
- El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
- Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
- Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
- Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
- Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
- Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279 (2011).
- Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).
