JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物学

תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

Published: December 01, 2016
doi:
10.3791/54774
,
1Department of Biology,South University of Science and Technology of China, Shenzhen, 2Mechanobiology Institute, Singapore, 3Department of Biomedical Engineering,National University of Singapore

Summary

אנו מציגים פרוטוקול עבור היישום של interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופי (iPALM), שיטה מיקרוסקופית 3 ממדי מולקולה בודדת לוקליזציה סופר רזולוציה, אל ההדמיה של שלד התא יקטין בתאי יונקים חסידים. גישה זו מאפשרת הדמיה מבוססת אור של תכונות מבניות ננו שאחרת נותרו לא פתורים על ידי מיקרוסקופיה אופטית-מוגבל עקיפה קונבנציונלית.

Abstract

מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר הדמיה ישירה של ביומולקולות ספציפיות בתוך תאים. עם זאת, עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי, ברזולוציה מרחבית מוגבלת על ידי עקיפה ל ~ 200 ננומטר בתוך המטוס תמונה> 500 ננומטר לאורך הציר האופטי. כתוצאה מכך, מיקרוסקופ פלואורסצנטי ארוך הוגבל קשות בהתבוננות תכונות ultrastructural בתוך תאים. ההתפתחות האחרונה של שיטות מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר יש להתגבר על מגבלה זו. בפרט, כניסתו של fluorophores photoswitchable מאפשרת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופרת מבוסס לוקליזציה, המספקת כושר הפרדה מתקרב המולקולרי באורך. כאן אנו מתארים את היישום של שיטה מיקרוסקופית תלת ממדי סופר רזולוציה המבוססת על מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת ו interferometry רב שלבית, שנקראה interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופי (iPALM). שיטה זו מספקת רזולוציה איזוטרופיים כמעט עלבסדר גודל של 20 ננומטר בכל שלושת הממדים. פרוטוקולים לדמיין את cytoskeleton יקטין פילמנטיות, כולל הכנת דגימת פעולת מכשיר iPALM, מתוארים כאן. פרוטוקולים אלה הם גם להתאמה ומאלף בקלות לחקר תכונות ultrastructural אחרות בתאים.

Introduction

הדמיה של מבנים הסלולר מורכב כבר זמן רב חלק בלתי נפרד תובנות ביולוגיות וגילוי. למרות מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכולים תאי תמונה עם ייחוד מולקולרי גבוה, כושר ההפרדה שלה הוא מוגבל על ידי דיפרקציה ל ~ 200 ננומטר במישור התמונה (x, y, או ממד לרוחב) ו> 500 ננומטר לאורך הציר האופטי (z, או ממד צירי) 1,2. לפיכך, התצפית של תכונות ultrastructural הסטוריות הוגבלה במיקרוסקופ אלקטרונים (EM). למרבה המזל, ההתפתחות האחרונה של מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר עקפה ממגבלה זו, מה שמאפשרת רזולוציה מרחבית של 10 – המגוון 100 ננומטר 1-6. בפרט, ברזולוציה סופר גישות המבוססת על לוקליזציה מולקולה בודדת, מוכרת בראשי תיבות כגון PALM (מיקרוסקופי לוקליזציה PhotoActivated) 4, FPALM (מיקרוסקופי לוקליזציה PhotoActivated קרינה) 5 (ד) STORM (מיקרוסקופי שחזור אופטי סטוכסטיים ישיר) 6,7, צבע ( Poהצטברות int עבור טופוגרפית ננו הדמיה) 8, GSDIM (קרקע מדינת דלדול מיקרוסקופי ואחריו לחזור מולקולרי בודד) 9, או SMACM (מולקולה בודדת Active-Control מיקרוסקופית) 10, וכן 3-ממדי (3D) ליישומם, כגון PALM interferometric (iPALM) 11 או 3D-STORM 12, כבר ערך בחשיפת תובנה רומן לתוך הארגון בקנה המידה ננומטרי של מבנים ביולוגיים רבים, בם אקסונים עצביים וסינפסות 13, מוקדי הידבקויות 14,15, צמתי תאי תאים 16, גרעיני נקבובי 17 , ו centrosomes 18-20, עד כמה שם.

תכונה נוספת ultrastructural בתאים עבורו מיקרוסקופ ברזולוציה סופר הוא שעשוי להיות שימושי הוא cytoskeleton אקטין. Meshwork המורכב של filamentous (ו) -actin בקליפת התא ממלא תפקיד חיוני בבקרה של צורה הסלולר תכונות מכאניות 21. ארגון of F- יקטין הוא פעיל באופן דינמי מוסדר אף חלבוני רגולטורים רבים משפיעים במידה רבה על פילמור, crosslinking, מחזור, יציבות, טופולוגיית רשת 22. עם זאת, למרות האפיון של אדריכלות meshwork F- יקטין חשוב תובנות מכניסטית לתוך מגוון רחב של תהליכים תאיים, בגודל הקטן (~ 8 ננומטר) של חוטי F- יקטין סלים לקיומם על ידי מיקרוסקופ אור-מוגבל עקיפה הקונבנציונלית; וכך, ההדמיה של מבנה עדין יקטין עד כה בוצעה באופן בלעדי על ידי EM. כאן אנו מתארים פרוטוקולים המאפשרים הדמית שלד תא F- יקטין בתאי יונקים חסידים, באמצעות טכניקת מיקרוסקופיה סופר רזולוצית iPALM לנצל יכולת הדיוק שלה גבוהה מאוד ב -3 D 11,23. למרות המכשיר iPALM מתמחה מאוד, הדרכה על הגדרת מכשיר כזה תוארה באחרונה 23, תוך גישה למיקרוסקופ iPALM בהנחיית הובמחלקה יוז רפואי מכון גם נעשה זמין לקהילה מחקר עם עלות מינימלית. בנוסף, שיטות הכנת הדגימה כפי שתתוארנה בהמשך חלות ישירות גישות ברזולוצית סופר 3D אלטרנטיביות, כמו אלו המבוססים על defocusing אסטיגמאטיק של פונקצית התפשטות נקודה (כוחות הביטחון הפלסטיני) 12 או דו-מטוס זיהוי 24, שהן לזמינות באופן נרחב יותר.

נציין כי מרכיב הכרחי עבור מיקרוסקופיה ברזולוציה הסופרת מבוססת לוקליזציה מולקולה בודדת בכלל הוא fluorophore photoswitchable 25, אשר מאפשר שלוש הדרישות הקריטיות עבור מיקרוסקופיה ברזולוציה סופרת מבוססת לוקליזציה מולקולה בודדת להתגשם: אני) מולקולה בודדת גבוהה בהירות יחסית בניגוד לאותות רקע; ii) ותפוצה דלילה של מולקולות בודדות בתוך מסגרת תמונה נתונה; ו- III) צפיפות מרחבית גבוהה של תיוג מספיק כדי ללכוד את הפרופיל של המבנה הבסיסי (הידוע גם בשם נייקוויסט-Shaקריטריון הדגימה nnon) 26. כך, תוצאות משביעות רצון, יש לשים דגש לא פחות משני ההכנה הנכונה של דגימות כדי לייעל photoswitching fluorophore וכדי לשמר את ultrastructure הבסיסית, כמו גם על היבטי מכשור ורכישת הניסויים.

Protocol

1. הכנת הדגימה הדמיה מאז אותות הקרינה רקע להפריע הקרינה מן תוויות fluorophore, לנקות את coverglasses ידי שטיפה אותם קודם במים דה מיונן (DDH 2 O) ולאחר מכן אוויר ייבוש אותם באמצעות אוויר דחוס. בהמשך לכך, לבצע תחריט הפלזמה שואב פלז…

Representative Results

דרישות קריטיות עבור iPALM הם יישור, רישום, וכיול של מערכות אופטיות. אלה נחוצים כדי להבטיח הפרעות מתאימיבתוך הנדרשים קרן splitter 3 כיוונים עבור z לתאם חילוץ. כדי לאפשר ניטור רציף, ממקורות נקודות קבועים של קרינה נחוצים. זו יכולה להיות מושגת באמצעות פלורסנט Au …

Discussion

המערכת האופטית של iPALM מבוסס על עיצוב המטרה 4-π כפול מתנגדים, כפי שמוצג באיור 1 א. ההתקנה נבנתה באמצעות שני-מותאם אישית במכונה ומסחרי חלקים אופטו-מכאני, כפי שתוארה קודם לכן 23 ו המפורטים בטבלת 1. בנוסף ההתקנה שלנו, המכון הרפואי הווארד יוז (H…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

YW ו PK בתודה להכיר תמיכה במימון קרן המחקר הלאומית של סינגפור, הוענק PK (NRF-NRFF-2011-04 ו NRF2012NRF-CRP001-084). אנו מודים גם במתקני מעבדת ליבת מיקרוסקופיה הפתוחים MBI עבור תמיכה בתשתיות.

Materials

optical table Newport, CA  RS4000 iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators 
vibration isolator for optical table Newport, CA  S-2000 
laser-642 Newport, CA  1185055 output power=100mw
laser-561 Newport, CA  1168931 output power=200mw
laser-488 Newport, CA  1137970 output power=200mw
laser-405 Newport, CA  1142279 output power=100mw
broadband dielectric mirrors  Thorlabs, NJ BB1-E02 laser combiner
dichroic beamsplitter  Semrock, NY LM01-427-25
acousto-optic tunable filter  AA Opto-Electronic, France AOTFnC-VIS-TN
Linear polarizer Newport, CA  05LP-VIS-B
baseplate local workshop customized
turning mirror (22.5°) Reynard Corpporation, CA customized 22.5° mirror
motorized optic mounts  New Focus, CA 8816
motorized XYZ translation stage Thorlabs, NJ MT3/M-Z6 sample holder
T-Cube DC servo motor controller Thorlabs, NJ TDC001
Piezo Phase Shifter Physik Instrumente, Germany S-303.CD
objective lens Nikon, Japan MRD01691 objective. Apo TIRF 60X/1.49oil
translation stage New Focus, CA 9062-COM-M
Pico Motor Actuator New Focus, CA 8301
rotary Solenoid/Shutter DACO Instruments, CT 5423-458
3-way beam splitter Rocky Mountain Instruments, CO customized beamsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scanner Physik Instrumente, Germany S-316.10
motorized five-axis tilt aligner  New Focus, CA 8081
Picmotor ethernet controller New Focus, CA 8752
Piezo controllers/amplifier/digital operation module Physik Instrumente, Germany E-509/E-503/E-517
band-pass filter Semrock, NY FF01-523/20 filters
band-pass filter Semrock, NY FF01-588/21
band-pass filter Semrock, NY FF01-607/30
band-pass filter Semrock, NY FF01-676/37
notch filter Semrock, NY NF01-405/488/561/635
motorized filter wheel with controllter Thorlabs, NJ FW103H
EMCCD Andor, UK  DU-897U-CSO-#BV 3 sets
Desktop computers for controlling cameras and synchronization Dell Precision T3500 PC, 4 sets
coverslips with fiducial Hestzig, VA 600-100AuF sample preparation. fiducial marks with various density and spectra  available
fibronectin  Millipore, MT FC010
paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, PA 15710 fixation. 16%
glutaraldehyde  Electron Microscopy Sciences, PA 16220 25%
triton X-100 Sigma aldrich, MO T8787
HUVEC cells Life Technologies, CA C-015-10C
Medium 200 Life Technologies, CA M-200-500
Large Vessel Endothelial Factors Life Technologies, CA A14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 14190367
Pennicillin/Streptomycin 15140122
Trypsin/EDTA Life Technologies, CA 25200056
PIPES Sigma aldrich, MO P1851 PHEM
HEPES 1st base, Malaysia BIO-1825
EGTA Sigma aldrich, MO E3889
MgCl2 Millipore, MT 5985
 Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen, CA A22287 staining
sodium borohydride (NaBH4)  Sigma aldrich, MO 480886 quenching
glucose 1st base, Malaysia BIO-1101 imaging buffer
glucose oxidase Sigma aldrich, MO G2133
catalase Sigma aldrich, MO C9322
cysteamine  Sigma aldrich, MO 30070
Epoxy Thorlabs, NJ G14250
vaseline Sigma aldrich, MO 16415 sample sealing
lanolin Sigma aldrich, MO L7387
parafin wax Sigma aldrich, MO 327204
Immersion oil  Electron Microscopy Sciences, PA 16915-04 imaging. Cargille Type HF
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
  2. Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
  3. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
  4. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  5. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
  6. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
  7. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
  8. Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
  9. Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
  10. Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
  11. Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
  12. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
  13. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
  14. Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).
  15. Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
  16. Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).
  17. Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
  18. Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
  19. Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
  20. Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
  21. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-492 (2010).
  22. Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
  23. Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
  24. Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
  25. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
  26. Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).
  27. Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. 生物化学. 5, 467-477 (1966).
  28. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
  29. Shin, W. D., Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L., et al. . Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2010).
  30. Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
  31. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
  32. Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
  33. Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. Visualization of Localization Microscopy Data. Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).
  34. El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
  35. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
  36. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
  37. Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
  38. Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
  39. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
  40. Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
  41. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
  42. Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279 (2011).
  43. Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
  44. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
  45. Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).

Tags

Keywords: 3D Super Resolution MicroscopyIPALMF-actin FilamentsUltrastructural VisualizationSingle Molecule LocalizationCell Sample PreparationImaging BufferCover Glass AssemblyEpoxy SealingNewton’s Rings Pattern
check_url/cn/54774?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wang, Y., Kanchanawong, P. Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). J. Vis. Exp. (118), e54774, doi:10.3791/54774 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image