البروتيوميات قياس الطيف الكتلي الموجه بسلالة الخلية في الجنين النامي (الضفدع)
Summary
نصف هنا توصيفا بروتينيا قائما على قياس الطيف الكتلي لسلالات الخلايا ذات مصائر الأنسجة المعروفة في جنين الفقاريات Xenopus laevis .
Abstract
إن توصيف الأحداث الجزيئية كخلايا تؤدي إلى ظهور الأنسجة والأعضاء يثير إمكانية فهم التطور الطبيعي بشكل أفضل وتصميم علاجات فعالة للأمراض. ومن شأن التكنولوجيات التي تمكن من التحديد الدقيق والقياس الكمي لمختلف أنواع البروتينات وأعدادها الكبيرة أن توفر معلومات لا تزال مفقودة عن الآليات الجزيئية التي تنظم تطور الأنسجة والكائنات الحية في المكان والزمان. هنا ، نقدم بروتوكولا قائما على قياس الطيف الكتلي يتيح قياس آلاف البروتينات في سلالات الخلايا المحددة في أجنة Xenopus laevis (الضفدع). يعتمد هذا النهج على خرائط مصير الخلية القابلة للتكرار والأساليب المعمول بها لتحديد الخلايا وذريتها (الحيوانات المستنسخة) وتسميتها بالفلورسنت وتتبعها وأخذ عينات منها من هذا النموذج لتطور الفقاريات. بعد جمع المحتويات الخلوية باستخدام أخذ العينات المجهرية أو عزل الخلايا عن طريق التشريح أو فرز الخلايا المنشط بالفلورة ، يتم استخراج البروتينات ومعالجتها للتحليل البروتيني من أسفل إلى أعلى. يتم استخدام الكروماتوغرافيا السائلة والرحلان الكهربائي الشعري لتوفير فصل قابل للتطوير للكشف عن البروتين والقياس الكمي باستخدام قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (HRMS). يتم توفير أمثلة تمثيلية للتوصيف البروتيني للخلايا المصيرية للأنسجة العصبية. بروتينات HRMS الموجهة بنسب الخلايا قابلة للتكيف مع الأنسجة والكائنات الحية المختلفة. إنه حساس ومحدد وكمي بما فيه الكفاية للنظر في الديناميات المكانية والزمانية للبروتين أثناء تطور الفقاريات.
Introduction
إن فهمنا لتمايز الخلايا ونشأة الأنسجة والأعضاء هو نتيجة عقود من الشاشات المستهدفة المعقدة للجينات ومنتجاتها. إن زيادة معرفتنا بجميع الجزيئات الحيوية وكمياتها خلال الأحداث الخلوية المهمة من شأنه أن يساعد في كشف الآليات الجزيئية التي تتحكم في الأنماط المكانية والزمانية لخطة جسم الفقاريات. أصبحت التقنيات التي تمكن من التضخيم الجزيئي والتسلسل قادرة الآن على الإبلاغ بشكل روتيني عن أعداد كبيرة من الجينات والنسخ ، مما يدعم الدراسات القائمة على الفرضيات في البحوث البيولوجية الأساسية والانتقالية. لفهم الأنظمة النامية ، تدعو العلاقة المعقدة بين النسخ والترجمة إلى التحليل المباشر للبروتينات المتعددة وتعديلاتها اللاحقة للترجمة. بدأت البروتينات العالمية التي تستخدم الأنظمة البيولوجية في المختبر ، مثل الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، في تحديد آليات تحريض الأنسجة 1,2. في الكائنات الحية المعقدة ، مثل جنين الفقاريات ، يعتمد التطور على تدرجات المورفوجين في سياق المكان والزمان3. ويترتب على ذلك أن اكتساب المعرفة بالتغيرات البروتينية مع تمايز الخلايا لتشكيل أنسجة متخصصة ، مثل الأنسجة العصبية ، يوفر مفتاحا لإطلاق البرامج الجزيئية التي تتحكم في التطور الطبيعي والمعيب وتوجيه علاجات الجيل التالي.
الضفدع ذو المخالب الفقارية في جنوب إفريقيا (Xenopus laevis) هو نموذج راسخ في البيولوجيا الخلوية والتنموية والعصبية والتجديدية. سلطت جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاءأو الطب 4,5 لعام 2012 التي حصل عليها السير جون جوردون لاكتشاف تعدد قدرات النواة الجسدية الضوء على أهمية هذا النموذج للاكتشافات في الدراسات الأساسية والانتقالية. تتطور أجنة Xenopus خارجيا إلى الأم ، مما يسهل التلاعب المباشر بالخلايا واستنساخ الخلايا والتعبير الجيني على مراحل مختلفة من التطور. مكن التصبغ غير المتماثل وانقسامات الخلايا النمطية من رسم خرائط المصير القابلة للتكرار من الجنين المكون من 16-6 و 32 خلية 7,8. بالنسبة للبروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (HRMS) ، تشمل المزايا الإضافية للنموذج حجما كبيرا نسبيا (~ 1 مم في القطر) ، والذي ينتج محتوى بروتينيا وفيرا للتحليل (~ 130 ميكروغرام في أجنة مرحلة الانقسام المبكرة ، ~ 10 ميكروغرام من محتوى البروتين في خلايا مفردة من الجنين المكون من 16 خلية)9,10.
في الوقت الحاضر ، HRMS هي التكنولوجيا الرائدة المفضلة للكشف عن البروتينات. تتيح هذه التقنية الكشف المباشر والحساس والمحدد والقياس الكمي للبروتينات المتعددة ، وعادة ما تكون مئات إلى آلاف البروتينات المختلفة11. تتضمن البروتينات من أسفل إلى أعلى بواسطة HRMS سلسلة من الخطوات المترابطة. بعد الاستخراج من عينة الخلية / الأنسجة ، يتم هضم البروتينات بإنزيم محلل للبروتين ، مثل التربسين (البروتينات من أسفل إلى أعلى). يتم فصل الببتيدات الناتجة بناء على خصائصها الفيزيائية والكيميائية المختلفة ، بما في ذلك الكارهة للماء (كروماتوغرافيا السائل ذات الطور العكسي ، LC) ، الشحنة الصافية (كروماتوغرافيا التبادل الأيوني) ، الحجم (كروماتوغرافيا استبعاد الحجم) ، أو الحركة الكهربائية (الرحلان الكهربائي الشعري ، CE). ثم يتم شحن الببتيدات (المتأينة) ، عادة باستخدام التأين بالرش الكهربائي (ESI) ، ويتم الكشف عن أيونات الببتيد وتسلسلها عبر تجزئة الطور الغازي بواسطة نظام إدارة الموارد البشرية الترادفي. يتم تعيين بيانات الببتيد الناتجة إلى بروتين الكائن الحي قيد الدراسة. مع ارتباط شدة إشارة أيون الببتيد الخاصة بالبروتين (البروتيني) بالتركيز ، يمكن إجراء القياس الكمي للبروتين بدون ملصق أو قائم على الملصق (تكميم تعدد الإرسال). تنتج بروتينات HRMS موردا غنيا من المعلومات حول الحالة الجزيئية للنظام قيد الدراسة ، مما يسمح بتوليد الفرضيات ومتابعة الدراسات الوظيفية.
الشكل 1: البروتينات القابلة للتطوير المكاني الزماني التي تمكن بروتينات HRMS الموجهة بنسب الخلية في الجنين النامي (الضفدع). (أ) تصور العينة (1) باستخدام مجهر مجسم (2) لحقن خلية محددة (أقحم) ، باستخدام ماصة دقيقة مصنعة (3) تحت السيطرة من خلال مرحلة الترجمة (4). ب: أخذ عينات تحت خلوية من الخلية D 11 اليسرى المحددة في جنين مكون من16 خلية. ج: تشريح خلية D 11 كاملة من جنين مكون من16 خلية. (د) تتبع الفلورسنت (الأخضر) لنسل D111 الأيسر والأيمن من جنين مكون من 32 خلية لتوجيه تشريح الأديم الظاهر العصبي (NE) في المعدة (المرحلة 10) وعزل النسيج المنحدر من الشرغوف باستخدام FACS. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر للأجنة ، 1.25 مم للقارورة. تم تكييف الأرقام بإذن من المراجع15،19،21،59. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يتيح البروتوكول المقدم هنا القياس الكمي القائم على نظام إدارة الموارد البشرية لأعداد كبيرة من البروتينات في الخلايا / الأنسجة المحددة في أجنة X. laevis النامية. يعتمد النهج على التحديد الدقيق للخلايا ، وخرائط مصير الخلية القابلة للتكرار ، والمنهجيات المعمول بها لتتبع سلالات الخلايا في هذا النموذج البيولوجي6،7،8. كما هو موضح في الشكل 1، ندرس البروتينات من الخلايا المفردة عن طريق استخدام تشريح الخلية الكاملة أو أخذ العينات المجهرية الشعرية لشفط المحتوى الخلوي. تسمح لنا مراقبة نسب الخلية بدراسة التطور الزماني المكاني للبروتين حيث تشكل الخلايا الأنسجة أثناء المعدة. يتم تمييز ذرية الخلية بالفلورسنت عن طريق حقن فلوروفور مترافق مع ديكستران خامل أو mRNA للبروتين الفلوري (على سبيل المثال ، بروتين الفلورسنت الأخضر ، أو GFP). يتم عزل النسل المسمى في النقاط الزمنية التطورية المطلوبة. أثناء المعدة ، يمكن عزل الحيوانات المستنسخة الخلوية المتجمعة بإحكام عن طريق التشريح. بعد المعدة ، يمكن توزيع استنساخ الخلايا داخل الجنين بسبب حركات الهجرة ويمكن عزلها عن الأنسجة المنفصلة عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS). يتم قياس البروتينات في هذه الخلايا والأنسجة عن طريق البروتينات من أسفل إلى أعلى باستخدام HPLC أو CE للفصل و ESI جنبا إلى جنب HRMS لتحديد الهوية. بروتينات HRMS الموجهة بنسب الخلايا قابلة للتطوير لأحجام وسلالات مختلفة داخل الجنين وهي محددة وحساسة وكميتة. من خلال أمثلة مختارة موضحة هنا ، نوضح أيضا أن هذا البروتوكول قابل للتطوير وقابل للتكيف على نطاق واسع مع أنواع مختلفة من الخلايا وسلالات الخلايا.
الشكل 2: سير عمل التحليل الحيوي. سهل التشريح الدقيق والشفط الشعري ، أو FACS أخذ عينات من محتوى البروتين الخلوي والنسيلي. استنفاد بروتينات صفار البيض الوفيرة وفصلها عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري (CE) أو كروماتوغرافيا السائل ذات التدفق النانوي (LC) حساسية التعريف المعززة (ID) باستخدام التأين الكهربائي (ESI) قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (HRMS). كشف القياس الكمي عن عدم التنظيم ، وتوفير معلومات جديدة للدراسات القائمة على الفرضيات بالتزامن مع المعلومات المتاحة من علم الوجود الجيني (GO). تم تكييف الأرقام بإذن من المرجع15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتيح هذا البروتوكول توصيف تعبير البروتين في سلالات الخلايا المحددة في أجنة أنواع Xenopus. انطلاقا من نظام إدارة الموارد البشرية ، تجمع المنهجية بين الخصوصية الرائعة في التحديد الجزيئي ، والقدرة على الكشف عن البروتينات المتعددة بدون تحقيقات جزيئية (عادة مئات إلى آلاف البروتينات المختلف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون ل Jie Li (جامعة ماريلاند ، كوليدج بارك) للمناقشات القيمة حول التفكك الجنيني و FACS. نشكر Vi M. Quach و Camille Lombard-Banek للمساعدة في إعداد العينات وجمع البيانات في الدراسات السابقة التي تجسد التطبيقات البروتينية التي تم تسليط الضوء عليها في هذا البروتوكول. تم دعم أجزاء من هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم تحت رقم الجائزة IOS-1832968 CAREER (إلى PN) ، والمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R35GM124755 (إلى PN) ، وبرنامج شراكة المعهد الوطني للسرطان بجامعة ماريلاند (إلى PN) ، وجوائز أبحاث مؤسسة COSMOS Club (إلى ABB و L.R.P.).
Materials
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | R0492 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher Scientific | A643-500 | |
| Analytical Column | Thermo Scientific | 164941 | |
| Analytical microbalance | Mettler-Toledo | XSE105DU | |
| Automatic peptide fractionation platform | Agilent | 1260 Infinity II | |
| Borosilicate Capillaries | Sutter Instruments Co. | B100-50-10 | |
| Borosilicate Capillaries (for making Emmitters) | Sutter Instruments | B100-75-10 | |
| C18 spin columns (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 89870 | |
| Camera ro monitor electrospray | Edmund Optics Inc. | EO-2018C | |
| Combretastatin A4 | Millipore Sigma | C7744 | |
| Commercial CESI system | AB SCIEX | CESI | |
| (Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS) | VWR | 97061-492 | |
| Cytochalasin D | Millipore Sigma | C8273 | |
| Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | ThermoFisher Scientific | D22910 | |
| Diothiothreitol | Fisher Scientific | FERR0861 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AAJ62786AP | |
| Epifluorescence light source | Lumencore | AURA III | |
| Eppendorf LoBing microcentrifuge tubes: protein | Fisher Scientific | 13-698-793 | |
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Scientific | TSX40086A | |
| Fused silica capillary | Molex | 1088150596 | |
| Heat Block | Benchmark | BSH300 | |
| High pressure liquid Chromatography System | ThermoFisher Scientific | Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | |
| High-resolution Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | |
| HPLC caps | Thermo Scientific | C4013-40A | |
| HPLC Vials | Thermo Scientific | C4013-11 | |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
| Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122275000 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Microcapillary puller | Suttor Instruments | P-2000 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Micropippette puller | Sutter Instruments Co. | P-1000 | |
| MS data analysis software, commercial | ProteomeDiscoverer | ||
| MS data analysis software, opensource | MaxQuant | ||
| non-idet 40 substitute | Millipore Sigma | 11754599001 | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Pierce 10 µL bed Zip-tips (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 87782 | |
| Pierce bicinchoninic acid protein assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pierce quantitative colorimetric peptide assay | ThermoFisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Trypsin Protease (MS Grade) | Fisher Scientific | PI90058 | |
| Protein LoBind vials | Eppendorf | 0030108434 , 0030108442 |
|
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Refrigerated Incubator | Thermo Scientific | PR505755R/3721 | |
| sodium isethionate | Millipore Sigma | 220078 | |
| sodium pyrophosphate | Sigma Aldrich | 221368-100G | |
| Stainless steel BGE vial | Custom-Built | ||
| Stainless steel sample vials | Custom-Built | ||
| Stereomicroscope (objective 10x) | Nikon | SMZ 1270, SZX18 | |
| Sucrose | VWR | 97063-790 | |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Syringes (gas-tight): 500–1000 µL | Hamilton | 1750TTL | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Trap Column | Thermo Scientific | 164750 | |
| Tris-HCl (1 M solution) | Fisher Scientific | AAJ22638AP | |
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10 °C | Labconco | 7310022 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-Built |
References
- Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
- Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells and their secretome during in vitro differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 612560 (2021).
- Christian, J. L. Morphogen gradients in development: From form to function. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 1 (1), 3-15 (2012).
- Gurdon, J. B., Elsdale, T. R., M, F. Sexually mature individuals of Xenopus laevis from the transplantation of single somatic nuclei. Nature. 182, 64-65 (1958).
- Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends in Genetics. 27 (12), 507-515 (2011).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. 发育生物学. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. 发育生物学. 122 (2), 300-319 (1987).
- Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
- Sun, L. L., et al. Single cell proteomics using frog (Xenopus laevis) blastomeres isolated from early stage embryos, which form a geometric progression in protein content. Analytical Chemistry. 88 (13), 6653-6657 (2016).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry for discovery proteomics: quantifying translational cell heterogeneity in the 16-cell frog (Xenopus) embryo. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (7), 2454-2458 (2016).
- Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chemical Reviews. 113 (4), 2343-2394 (2013).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , (2000).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Gupta, M., Sonnett, M., Ryazanova, L., Presler, M., Wuhr, M., Vleminckx, K. Quantitative proteomics of xenopus embryos I, sample preparation. Xenopus. Methods in Molecular Biology. 1865, 175-194 (2018).
- Baxi, A. B., Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Proteomic characterization of the neural ectoderm fated cell clones in the Xenopus laevis embryo by high-resolution mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 2064-2073 (2018).
- Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods in Molecular Biology. 135, 331-347 (2000).
- Sater, A. K., Moody, S. A. Using Xenopus to understand human diseases and developmental disorders. Genesis. 55 (1-2), 1-14 (2017).
- Lombard-Banek, C., Choi, S. B., Nemes, P., Allbritton, N. L., Kovarik, M. L. . Enzyme Activity in Single Cells. Methods in Enzymology. 628, 263-292 (2019).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. High-sensitivity mass spectrometry for probing gene translation in single embryonic cells in the early frog (Xenopus) embryo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 11 (2016).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. Microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (Xenopus laevis) embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56956 (2017).
- Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Manzin, M. C., Nemes, P. Microsampling capillary electrophoresis mass spectrometry enables single-cell proteomics in complex tissues: developing cell clones in live Xenopus laevis and zebrafish embryos. Analytical Chemistry. 91 (7), 4797-4805 (2019).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. 发育生物学. 120 (1), 299-304 (1987).
- Karimi, K., et al. Xenbase: a genomic, epigenomic and transcriptomic model organism database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 861-868 (2018).
- Kakebeen, A. D., Chitsazan, A. D., Wills, A. E. Tissue disaggregation and isolation of specific cell types from transgenic Xenopus appendages for transcriptional analysis by FACS. Developmental Dynamics. 250 (9), 1381-1392 (2021).
- Garcia, B. A. What does the future hold for top down mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 193-202 (2010).
- Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in top-down proteomics and the analysis of proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. (Palo Alto Calif). 9 (1), 499-519 (2016).
- Zhang, Z. B., Dubiak, K. M., Huber, P. W., Dovichi, N. J. Miniaturized filter-aided sample preparation (MICRO-FASP) method for high throughput, ultrasensitive proteomics sample preparation reveals proteome asymmetry in Xenopus laevis Embryos. Analytical Chemistry. 92 (7), 5554-5560 (2020).
- Wisniewski, J. R., Becher, D. . Microbial Proteomics: Methods and Protocols.Methods in Molecular Biology. 1841, 3-10 (2018).
- Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
- Zhu, Y., et al. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells. Nature Communications. 9, 882 (2018).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute-solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
- Jiang, L., He, L., Fountoulakis, M. Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis. Journal of Chromatography A. 1023 (2), 317-320 (2004).
- Hildonen, S., Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Why less is more when generating tryptic peptides in bottom-up proteomics. Proteomics. 14 (17-18), 2031-2041 (2014).
- Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19, 161 (2018).
- Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-mass spectrometry at trial by metabo-ring: effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
- Sun, L. L., Zhu, G. J., Zhang, Z. B., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-generation electrokinetically pumped sheath-flow nanospray interface with improved stability and sensitivity for automated capillary zone electrophoresis-mass spectrometry analysis of complex proteome digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
- DeLaney, K., Sauer, C. S., Vu, N. Q., Li, L. J. Recent advances and new perspectives in capillary electrophoresis-mass spectrometry for single cell "omics". Molecules. 24 (1), 21 (2019).
- Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Protocols. 8 (4), 783-799 (2013).
- Choi, S. B., Zamarbide, M., Manzini, M. C., Nemes, P. Tapered-tip capillary electrophoresis nano-electrospray ionization mass spectrometry for ultrasensitive proteomics: the mouse cortex. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (4), 597-607 (2017).
- Pino, L. K., Rose, J., O’Broin, A., Shah, S., Schilling, B. Emerging mass spectrometry-based proteomics methodologies for novel biomedical applications. Biochemical Society Transactions. 48 (5), 1953-1966 (2020).
- Chen, C., Hou, J., Tanner, J. J., Cheng, J. L. Bioinformatics methods for mass spectrometry-based proteomics data analysis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 25 (2020).
- Peshkin, L., et al. On the relationship of protein and mRNA dynamics in vertebrate embryonic development. Developmental Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Mi, H. Y., et al. PANTHER version 16: a revised family classification, tree-based classification tool, enhancer regions and extensive api. Nucleic Acids Research. 49, 394-403 (2021).
- Schmidt, E., et al. . On the Move Federated Workshops. , 710-719 (2006).
- Deutsch, E. W., et al. Trans-Proteomic pipeline, a standardized data processing pipeline for large-scale reproducible proteomics informatics. Proteomics Clinical Applications. 9 (7-8), 745-754 (2015).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Demsar, J., et al. Orange: Data mining toolbox in Python. Journal of Machine Learning Research. 14, 2349-2353 (2013).
- Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. Journal of Proteome Research. 8 (5), 2144-2156 (2009).
- Jensen, L. J., et al. STRING 8 – a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic Acids Research. 37, 412-416 (2009).
- Schweppe, D. K., Huttlin, E. L., Harper, J. W., Gygi, S. P. BioPlex display: an interactive suite for large-scale AP-MS protein-protein interaction data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 722-726 (2018).
- Hornbeck, P. V., et al. PhosphoSitePlus, 2014: mutations, PTMs and recalibrations. Nucleic Acids Research. 43, 512-520 (2015).
- Letunic, I., Khedkar, S., Bork, P. SMART: recent updates, new developments and status in 2020. Nucleic Acids Research. 49, 458-460 (2021).
- Lombard-Banek, C., et al. In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis). Angewandte Chemie-International Edition. 60 (23), 12852-12858 (2021).
- Lombard-Banek, C., Reddy, S., Moody, S. A., Nemes, P. Label-free quantification of proteins in single embryonic cells with neural fate in the cleavage-stage frog (Xenopus laevis) embryo using capillary electrophoresis electrospray ionization high-resolution mass spectrometry (CE-ESI-HRMS). Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2756-2768 (2016).
- Saha-Shah, A., et al. Single cell proteomics by data-independent acquisition to study embryonic asymmetry in Xenopus laevis. Analytical Chemistry. 91 (14), 8891-8899 (2019).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Analytical Chemistry. 89 (13), 7069-7076 (2017).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
