발달 중인 (개구리) 배아의 세포 계통 유도 질량 분석법 단백질체학
Summary
여기에서 우리는 척추동물 Xenopus laevis 배아에서 알려진 조직 운명을 가진 세포 계통의 질량 분석 기반 단백질체 특성 분석을 설명합니다.
Abstract
세포가 조직과 기관을 생성함에 따라 분자 사건의 특성화는 정상적인 발달을 더 잘 이해하고 질병에 대한 효율적인 치료법을 설계할 수 있는 잠재력을 높입니다. 다양한 유형과 많은 수의 단백질을 정확하게 식별하고 정량화할 수 있는 기술은 공간과 시간에서 조직과 유기체 발달을 조율하는 분자 메커니즘에 대한 정보를 여전히 제공하지 못할 것입니다. 여기에서 우리는 Xenopus laevis (개구리) 배아에서 확인된 세포 계통에서 수천 개의 단백질을 측정할 수 있는 질량 분석 기반 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 재현 가능한 세포-운명 지도와 이 척추동물 발달 모델에서 세포와 그 자손(클론)을 식별, 형광 표지, 추적 및 샘플링하는 확립된 방법을 기반으로 합니다. 마이크로 샘플링을 사용하여 세포 내용물을 수집하거나 해부 또는 형광 활성화 세포 분류를 통해 세포를 분리한 후 단백질을 추출하고 처리하여 상향식 단백질체학 분석을 수행합니다. 액체 크로마토그래피 및 모세관 전기영동은 고분해능 질량분석법(HRMS)을 통해 단백질 검출 및 정량화를 위한 확장 가능한 분리를 제공하는 데 사용됩니다. 대표적인 예가 신경-조직 운명 세포의 프로테오믹 특성화에 대해 제공된다. 세포 계통 유도 HRMS 단백질체학은 다양한 조직과 유기체에 적용할 수 있습니다. 척추동물 발달 동안 프로테옴의 시공간적 역학을 들여다보기에 충분히 민감하고 구체적이며 정량적입니다.
Introduction
세포 분화와 조직 및 기관의 기원에 대한 우리의 이해는 수십 년 동안 유전자와 그 산물에 대한 정교한 표적 스크리닝의 결과입니다. 중요한 세포 사건 동안 모든 생체 분자와 그 양에 대한 지식을 늘리면 척추 동물 신체 계획의 공간적 및 시간적 패턴을 제어하는 분자 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 분자 증폭 및 시퀀싱을 가능하게 하는 기술은 이제 많은 수의 유전자와 전사체에 대해 일상적으로 보고할 수 있어 기초 생물학 및 중개 연구에서 가설 기반 연구를 지원합니다. 개발 중인 시스템을 이해하기 위해 전사와 번역 간의 복잡한 관계는 여러 단백질의 직접 분석과 번역 후 변형을 지지합니다. 유도만능줄기세포와 같은 시험관 내 생물학적 시스템을 사용하는 글로벌 단백질체학은 조직 유도 1,2의 메커니즘을 설명하기 시작했습니다. 척추동물 배아와 같은 복잡한 유기체에서 발달은 공간과 시간의 맥락에서 모르포겐 구배에 의존한다3. 따라서 세포가 분화하여 신경 조직과 같은 특수 조직을 형성함에 따라 단백질체학적 변화에 대한 지식을 얻는 것은 정상 및 결함 발달을 제어하는 분자 프로그램을 잠금 해제하고 차세대 치료법을 안내하는 열쇠를 제공합니다.
척추동물 남아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis)는 세포 및 발달, 신경 및 재생 생물학에서 잘 확립된 모델입니다. 체세포의 다능성 발견에 대한 John Gurdon 경의 2012년 노벨 생리의학상 4,5는 기초 및 중개 연구의 발견에 대한 이 모델의 중요성을 강조했습니다. Xenopus 배아는 모체 외부에서 발달하여 다양한 발달 단계에서 세포, 세포 클론 및 유전자 발현의 직접적인 조작을 용이하게 합니다. 비대칭 색소 침착과 고정 관념의 세포 분열은 16-6 및 32 세포 7,8 단계 배아에서 재현 가능한 운명지도의 차트를 가능하게했습니다. 고분해능 질량분석법(HRMS) 기반 단백질체학의 경우, 이 모델의 추가적인 장점은 분석을 위한 풍부한 단백질 함량을 산출하는 비교적 큰 크기(직경 ~1mm)를 포함합니다(초기 절단 단계 배아에서 ~130μg, 16세포 배아의 단일 세포에서 ~10μg의 단백질 함량)9,10.
현재 HRMS는 단백질 검출을 위한 선도적인 기술입니다. 이 기술은 일반적으로 수백에서 수천 개의 서로 다른 단백질을 직접적이고 민감하며 특이적으로 검출하고 정량화할 수 있게 한다11. HRMS에 의한 상향식 단백질체학은 일련의 상호 연결된 단계를 포함합니다. 세포/조직 샘플에서 추출한 후 단백질은 트립신(상향식 단백질체학)과 같은 단백질 분해 효소로 분해됩니다. 생성된 펩타이드는 소수성(reversed-phase liquid chromatography, LC), 순 전하(ion-exchange chromatography), 크기(size exclusion chromatography) 또는 전기영동 이동도(capillary electrophoresis, CE)를 포함한 다양한 물리화학적 특성에 따라 분리됩니다. 그런 다음 펩타이드는 일반적으로 전기분무 이온화(ESI)를 사용하여 충전(이온화)되며, 탠덤 HRMS에 의한 기체상 단편화를 통해 펩타이드 이온이 검출 및 시퀀싱됩니다. 결과 펩타이드 데이터는 연구 중인 유기체의 프로테옴에 매핑됩니다. 농도와 상관관계가 있는 단백질 특이적(proteotypic) 펩타이드 이온 신호 강도를 이용하여, 단백질 정량화는 비표지 또는 표지 기반(multiplexing quantitation)으로 수행될 수 있다. HRMS 단백질체학은 연구 중인 시스템의 분자 상태에 대한 풍부한 정보 리소스를 제공하여 가설 생성 및 후속 기능 연구를 가능하게 합니다.
그림 1: 발달 중인 (개구리) 배아에서 세포 계통 유도 HRMS 단백질체학을 가능하게 하는 시공간적으로 확장 가능한 단백질체학. (A) 평행 전단 (4)에 의해 제어되는 제작된 마이크로피펫 (3)을 사용하여 확인된 세포(삽입물)의 주입을 위한 실체현미경(2)을 이용한 표본 (1)의 가시화. (B) 16-세포 배아에서 확인된 왼쪽D11 세포의 세포하 샘플링. (C) 16-세포 배아로부터 전체D11 세포의 해부. (D) 32세포 배아에서 왼쪽 및 오른쪽 D111 자손의 형광(녹색) 추적으로 위스트룰라에서 신경 외배엽(NE)의 해부(10단계) 및 FACS를 사용하여 올챙이에서 자손 조직 분리를 안내합니다. 스케일 바: 배아의 경우 200μm, 바이알의 경우 1.25mm. 수치는 참고 문헌 15,19,21,59의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
여기에 제시된 프로토콜은 발달 중인 X. laevis 배아에서 확인된 세포/조직에서 많은 수의 단백질에 대한 HRMS 기반 정량화를 가능하게 합니다. 이 접근법은 정확한 세포 식별, 재현 가능한 세포 운명 지도 및 이 생물학적 모델 6,7,8에서 세포 계통을 추적하기 위한 확립된 방법론을 기반으로 합니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이, 우리는 세포 내용물을 흡인하기 위해 전체 세포 해부 또는 모세관 마이크로 샘플링을 사용하여 단일 세포에서 프로테옴을 연구합니다. 세포의 혈통을 모니터링하면 세포가 위장 중에 조직을 형성함에 따라 프로테옴의 시공간 진화를 연구할 수 있습니다. 세포 자손은 형광 단백질(예: 녹색 형광 단백질 또는 GFP)에 대해 불활성 덱스트란 또는 mRNA에 접합된 형광단을 주입하여 형광을 표시합니다. 표지된 자손은 원하는 발달 시점에서 분리됩니다. gastrulation 동안, 단단히 클러스터링된 세포 클론은 해부에 의해 분리될 수 있습니다. 위축 후, 세포 클론은 이동 운동으로 인해 배아 내에 분포할 수 있으며 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 해리된 조직에서 분리될 수 있습니다. 이러한 세포 및 조직의 단백질은 분리를 위해 HPLC 또는 CE를 사용하고 식별을 위해 ESI 탠덤 HRMS를 사용하는 상향식 단백질체학을 통해 측정됩니다. 세포 계통 유도 HRMS 단백질체학은 배아 내에서 다양한 세포 크기와 계통으로 확장 가능하며 특이적이고 민감하며 정량적입니다. 여기에 표시된 선별된 예를 통해 이 프로토콜이 다양한 유형의 세포 및 세포 계통에 확장 가능하고 광범위하게 적응할 수 있음을 보여줍니다.
그림 2: 바이오분석 워크플로우. 미세 해부 및 모세관 흡인 또는 FACS는 세포 및 클론 단백질 함량의 샘플링을 용이하게 했습니다. 풍부한 난황 단백질의 고갈 및 모세관 전기영동(CE) 또는 나노 유동 액체 크로마토그래피(LC)에 의한 분리는 전기분무 이온화(ESI) 고분해능 질량분석법(HRMS)을 사용하여 식별(ID) 감도를 향상시킵니다. 정량화는 유전자 온톨로지(GO)에서 사용할 수 있는 정보와 함께 가설 기반 연구를 위한 새로운 정보를 제공하는 조절 장애를 드러냈습니다. 수치는 참고 문헌15의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 Xenopus 종의 배아에서 확인된 세포 계통에서 단백질 발현의 특성화를 가능하게 합니다. HRMS에서 비롯된 이 방법론은 분자 식별의 정교한 특이성, 분자 프로브 없이 다중 단백질 검출 기능(일반적으로 수백에서 수천 개의 서로 다른 단백질) 및 정량 기능을 결합합니다. 세포 및 발달 (신경) 생물학의 고전적인 도구 및 워크플로우에 대한 적응성은 척추동물 X. laevis 배아에?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
배아 해리 및 FACS에 대한 귀중한 토론을 해주신 Jie Li (University of Maryland, College Park)에게 감사드립니다. 이 프로토콜에서 강조된 단백질체학 응용 분야를 예시하는 이전 연구에서 샘플 준비 및 데이터 수집에 도움을 준 Vi M. Quach와 Camille Lombard-Banek에게 감사드립니다. 이 연구의 일부는 수상 번호 IOS-1832968 CAREER(PN으로), 국립 보건원(National Institutes of Health)에서 수상 번호 R35GM124755(PN), 메릴랜드 대학교-국립 암 연구소 파트너십 프로그램(PN) 및 COSMOS Club Foundation 연구 상(ABB 및 LRP)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | R0492 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher Scientific | A643-500 | |
| Analytical Column | Thermo Scientific | 164941 | |
| Analytical microbalance | Mettler-Toledo | XSE105DU | |
| Automatic peptide fractionation platform | Agilent | 1260 Infinity II | |
| Borosilicate Capillaries | Sutter Instruments Co. | B100-50-10 | |
| Borosilicate Capillaries (for making Emmitters) | Sutter Instruments | B100-75-10 | |
| C18 spin columns (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 89870 | |
| Camera ro monitor electrospray | Edmund Optics Inc. | EO-2018C | |
| Combretastatin A4 | Millipore Sigma | C7744 | |
| Commercial CESI system | AB SCIEX | CESI | |
| (Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS) | VWR | 97061-492 | |
| Cytochalasin D | Millipore Sigma | C8273 | |
| Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | ThermoFisher Scientific | D22910 | |
| Diothiothreitol | Fisher Scientific | FERR0861 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AAJ62786AP | |
| Epifluorescence light source | Lumencore | AURA III | |
| Eppendorf LoBing microcentrifuge tubes: protein | Fisher Scientific | 13-698-793 | |
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Thermo Scientific | TSX40086A | |
| Fused silica capillary | Molex | 1088150596 | |
| Heat Block | Benchmark | BSH300 | |
| High pressure liquid Chromatography System | ThermoFisher Scientific | Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | |
| High-resolution Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | |
| HPLC caps | Thermo Scientific | C4013-40A | |
| HPLC Vials | Thermo Scientific | C4013-11 | |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
| Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122275000 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Microcapillary puller | Suttor Instruments | P-2000 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Micropippette puller | Sutter Instruments Co. | P-1000 | |
| MS data analysis software, commercial | ProteomeDiscoverer | ||
| MS data analysis software, opensource | MaxQuant | ||
| non-idet 40 substitute | Millipore Sigma | 11754599001 | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Pierce 10 µL bed Zip-tips (for desalting) | ThermoFisher Scientific | 87782 | |
| Pierce bicinchoninic acid protein assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pierce quantitative colorimetric peptide assay | ThermoFisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Trypsin Protease (MS Grade) | Fisher Scientific | PI90058 | |
| Protein LoBind vials | Eppendorf | 0030108434 , 0030108442 |
|
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Refrigerated Incubator | Thermo Scientific | PR505755R/3721 | |
| sodium isethionate | Millipore Sigma | 220078 | |
| sodium pyrophosphate | Sigma Aldrich | 221368-100G | |
| Stainless steel BGE vial | Custom-Built | ||
| Stainless steel sample vials | Custom-Built | ||
| Stereomicroscope (objective 10x) | Nikon | SMZ 1270, SZX18 | |
| Sucrose | VWR | 97063-790 | |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Syringes (gas-tight): 500–1000 µL | Hamilton | 1750TTL | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Trap Column | Thermo Scientific | 164750 | |
| Tris-HCl (1 M solution) | Fisher Scientific | AAJ22638AP | |
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10 °C | Labconco | 7310022 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-Built |
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