JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
化学

Gelişmekte Olan (Kurbağa) Embriyoda Hücre-Soy Kılavuzlu Kütle Spektrometrisi Proteomikleri

Published: April 21, 2022
doi:
10.3791/63586
, ,
1Department of Chemistry & Biochemistry,University of Maryland, 2Department of Anatomy & Cell Biology,The George Washington University

Summary

Burada, omurgalı Xenopus laevis embriyosunda bilinen doku kaderlerine sahip hücre soylarının kütle spektrometrisine dayalı proteomik karakterizasyonu açıklanmaktadır.

Abstract

Moleküler olayların hücreler doku ve organlara yol açtıkça karakterizasyonu, normal gelişimi daha iyi anlama ve hastalıklar için etkili ilaçlar tasarlama potansiyelini artırmaktadır. Çeşitli tiplerin ve çok sayıda proteinin doğru bir şekilde tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlayan teknolojiler, uzay ve zamanda doku ve organizma gelişimini düzenleyen moleküler mekanizmalar hakkında hala eksik bilgi sağlayacaktır. Burada, Xenopus laevis (kurbağa) embriyolarında tanımlanmış hücre soylarındaki binlerce proteinin ölçülmesini sağlayan kütle spektrometrisine dayalı bir protokol sunuyoruz. Yaklaşım, tekrarlanabilir hücre-kader haritalarına ve bu omurgalı gelişim modelinden hücreleri ve soylarını (klonlarını) tanımlamak, floresan olarak etiketlemek, izlemek ve örneklemek için yöntemler üzerine kuruludur. Diseksiyon veya floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile mikro örnekleme veya izole hücreler kullanılarak hücresel içerik toplandıktan sonra, proteinler aşağıdan yukarıya proteomik analiz için ekstrakte edilir ve işlenir. Sıvı kromatografisi ve kılcal elektroforez, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (HRMS) ile protein tespiti ve nicelleştirilmesi için ölçeklenebilir ayırma sağlamak için kullanılır. Nöral-doku kaderi olan hücrelerin proteomik karakterizasyonu için temsili örnekler verilmiştir. Hücre soy rehberliğinde HRMS proteomik, farklı doku ve organizmalara uyarlanabilir. Omurgalı gelişimi sırasında proteomun uzaysal-zamansal dinamiklerine bakmak için yeterince hassas, spesifik ve nicelikseldir.

Introduction

Hücre farklılaşması ve doku ve organların oluşumu hakkındaki anlayışımız, genlerin ve ürünlerinin onlarca yıllık ayrıntılı hedeflenmiş ekranlarının sonucudur. Önemli hücresel olaylar sırasında tüm biyomoleküller ve miktarları hakkındaki bilgimizi arttırmak, omurgalı vücut planının mekansal ve zamansal modellemesini kontrol eden moleküler mekanizmaların çözülmesine yardımcı olacaktır. Moleküler amplifikasyon ve dizilemeyi mümkün kılan teknolojiler artık çok sayıda gen ve transkript hakkında rutin olarak rapor verebilmekte ve temel biyolojik ve translasyonel araştırmalarda hipotez odaklı çalışmaları desteklemektedir. Gelişmekte olan sistemleri anlamak için, transkripsiyon ve çeviri arasındaki karmaşık bir ilişki, çoklu proteinlerin ve bunların çeviri sonrası modifikasyonlarının doğrudan analizini savunur. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler gibi in vitro biyolojik sistemleri kullanan küresel proteomikler, doku indüksiyon mekanizmalarını tanımlamaya başladı 1,2. Omurgalı embriyosu gibi karmaşık organizmalarda gelişim, uzay ve zaman bağlamında morfojen gradyanlarına dayanır3. Hücreler sinir dokuları gibi özel dokular oluşturmak için farklılaştıkça proteomik değişiklikler hakkında bilgi edinmenin, normal ve kusurlu gelişimi kontrol eden moleküler programların kilidini açmak ve yeni nesil terapötiklere rehberlik etmek için bir anahtar sunduğu anlaşılmaktadır.

Omurgalı Güney Afrika pençeli kurbağası (Xenopus laevis), hücre ve gelişimsel, nöro ve rejeneratif biyolojide köklü bir modeldir. Sir John Gurdon’un somatik çekirdeğin pluripotensinin keşfi için 2012 Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü 4,5, bu modelin temel ve translasyonel çalışmalardaki keşifler için önemini vurguladı. Xenopus embriyoları anneye dışarıdan gelişir, böylece hücrelerin, hücre klonlarının ve gen ekspresyonunun gelişimin çeşitli aşamalarında doğrudan manipülasyonunu kolaylaştırır. Asimetrik pigmentasyon ve basmakalıp hücre bölünmeleri, 16-6 ve 32 hücreli 7,8 aşamalı embriyodan tekrarlanabilir kader haritalarının çizilmesini sağladı. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HRMS) tabanlı proteomikler için, modelin ek avantajları, analiz için bol miktarda protein içeriği sağlayan nispeten büyük boyutu (~ 1 mm çapında) içerir (erken bölünme aşamasındaki embriyolarda ~ 130 μg, 16 hücreli embriyonun tek hücrelerinde ~ 10 μg protein içeriği)9,10.

Şu anda, HRMS, proteinleri tespit etmek için tercih edilen önde gelen teknolojidir. Bu teknoloji, çoklu, genellikle yüzlerce-binlerce farklı proteinin doğrudan, hassas ve spesifik olarak algılanmasını ve nicelleştirilmesini sağlar11. HRMS tarafından aşağıdan yukarıya proteomik, birbirine bağlı bir dizi adımı içerir. Hücre / doku örneğinden ekstraksiyonu takiben, proteinler tripsin (aşağıdan yukarıya proteomik) gibi proteolitik bir enzimle sindirilir. Elde edilen peptitler, hidrofobiklik (ters fazlı sıvı kromatografisi, LC), net yük (iyon değişim kromatografisi), boyut (boyut dışlama kromatografisi) veya elektroforetik hareketlilik (kılcal elektroforez, CE) dahil olmak üzere farklı fizikokimyasal özelliklerine göre ayrılır. Peptitler daha sonra tipik olarak elektrosprey iyonizasyonu (ESI) kullanılarak yüklenir (iyonize edilir) ve peptid iyonları tandem HRMS ile gaz fazı parçalanması yoluyla tespit edilir ve sıralanır. Elde edilen peptit verileri, incelenen organizmanın proteomu ile eşleştirilir. Proteine özgü (proteotik) peptid iyon sinyal yoğunluğu konsantrasyon ile korelasyon gösterdiğinde, protein nicelleştirmesi etiketsiz veya etiket bazlı (çoklama kantitasyonu) gerçekleştirilebilir. HRMS proteomikleri, incelenen sistemin moleküler durumu hakkında zengin bir bilgi kaynağı sunarak, hipotezlerin üretilmesine ve fonksiyonel çalışmaların izlenmesine olanak tanır.

Figure 1
Şekil 1: Gelişmekte olan (kurbağa) embriyoda hücre-soy rehberliğinde HRMS proteomiklerini sağlayan mekansal olarak ölçeklenebilir proteomikler. (A) Numunenin (1) tanımlanmış bir hücrenin (iç kısım) enjeksiyonu için stereomikroskop (2) kullanılarak, bir çeviri aşaması (4) tarafından kontrol altında tutulan fabrikasyon bir mikropipet (3) kullanılarak görselleştirilmesi. (B) 16 hücreli bir embriyoda tanımlanan sol D11 hücresinin hücre altı örneklemesi. (C) 16 hücreli bir embriyodan bütün bir D11 hücresinin diseksiyonu. (D) Gastruladaki nöral ektodermin (NE) diseksiyonuna rehberlik etmek için 32 hücreli bir embriyodan sol ve sağ D111 döllerinin floresan (yeşil) izlenmesi (evre 10) ve FACS kullanılarak kurbağa yavrusundan inen dokunun izolasyonu. Ölçek çubukları: embriyolar için 200 μm, şişe için 1.25 mm. Rakamlar 15,19,21,59 referanslarından izin alınarak uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Burada sunulan protokol, gelişmekte olan X. laevis embriyolarında tanımlanmış hücrelerde / dokularda çok sayıda proteinin HRMS tabanlı nicelleştirilmesini sağlar. Yaklaşım, doğru hücre tanımlama, tekrarlanabilir hücre kader haritaları ve bu biyolojik model 6,7,8’deki hücre soylarını izlemek için yerleşik metodolojiler üzerine kuruludur. Şekil 1’de gösterildiği gibi, hücresel içeriği aspire etmek için tüm hücre diseksiyonu veya kılcal mikro örnekleme kullanarak tek hücrelerden proteomları inceliyoruz. Bir hücrenin soyunu izlemek, hücreler gastrulasyon sırasında dokular oluştururken proteomun uzaysal zamansal evrimini incelememize izin verir. Hücre soyunun, floresan protein (örneğin, yeşil floresan proteini veya GFP) için inert dekstran veya mRNA’ya konjuge edilmiş bir florofor enjekte edilmesiyle floresan olarak işaretlenir. Etiketli döl, istenen gelişimsel zaman noktalarında izole edilir. Gastrulasyon sırasında, sıkıca kümelenmiş hücre klonları diseksiyon ile izole edilebilir. Gastrulasyondan sonra, hücre klonları göç hareketleri nedeniyle embriyo içinde dağıtılabilir ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ile ayrışmış dokulardan izole edilebilir. Bu hücre ve dokulardaki proteinler, ayırma için HPLC veya CE ve tanımlama için ESI tandem HRMS kullanılarak aşağıdan yukarıya proteomiklerle ölçülür. Hücre soyu rehberliğinde HRMS proteomikleri, embriyo içindeki farklı hücre boyutlarına ve soylarına ölçeklenebilir ve spesifik, hassas ve kantitatiftir. Burada gösterilen seçkin örnekler aracılığıyla, bu protokolün ölçeklenebilir olduğunu ve farklı hücre türlerine ve hücre soylarına geniş ölçüde uyarlanabileceğini de gösteriyoruz.

Figure 2
Şekil 2: Biyoanalitik iş akışı. Mikro-diseksiyon ve kılcal aspirasyon veya FACS, hücresel ve klonal protein içeriğinin örneklenmesini kolaylaştırdı. Bol miktarda yumurta sarısı proteininin tükenmesi ve kılcal elektroforez (CE) veya nano-akış sıvı kromatografisi (LC) ile ayrılması, elektrosprey iyonizasyon (ESI) yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (HRMS) kullanılarak gelişmiş tanımlama (ID) hassasiyeti. Niceliklendirme, gen ontolojisinden (GO) elde edilen bilgilerle bağlantılı olarak hipotez odaklı çalışmalar için yeni bilgiler sağlayan düzensizliği ortaya çıkardı. Şekillerreferans 15’ten izin alınarak uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

Xenopus laevis yetişkin kurbağalarının insancıl bakımını ve kullanımını sağlayan tüm protokoller, Maryland Üniversitesi, College Park’taki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (Onay numaraları R-DEC-17-57 ve R-FEB-21-07). 1. Çözümleri hazırlayın Embriyoloji için1x, 0.5x ve 0.2x Steinberg çözeltisini (SS) hazırlayın, ardından standart protokoller12’yi izleyerek …

Representative Results

Bu protokol, X. laevis embriyolarında doku oluştururken tek hücrelerdeki proteinlerin ve soylarının incelenmesini sağlamıştır. Şekil 1, nöral-doku-kader hücrelerindeki proteinleri ve embriyodaki yeni indüklenen nöral ektodermi incelemek için yaklaşımın böyle bir uygulamasını göstermektedir. Şekil 1A’da gösterildiği gibi, biyoanalitik iş akışı, hücreleri tanımlamak, enjekte etmek / aspire etmek ve örnekleri toplamak için …

Discussion

Bu protokol, Xenopus türlerinin embriyolarında tanımlanmış hücre soylarında protein ekspresyonunun karakterizasyonunu sağlar. HRMS’den kaynaklanan metodoloji, moleküler tanımlamada mükemmel özgüllüğü, moleküler problar (genellikle yüzlerce ila binlerce farklı protein) olmadan çoklu protein tespiti yeteneğini ve niceleme yeteneğini birleştirir. Hücre ve gelişimsel (nöro) biyolojideki klasik araçlara ve iş akışlarına uyarlanabilirlik, HRMS proteomiklerini, omurgalı X. laevis </e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Jie Li’ye (Maryland Üniversitesi, College Park) embriyonik ayrışma ve FACS hakkındaki değerli tartışmalar için minnettarız. Vi M. Quach ve Camille Lombard-Banek’e, bu protokolde vurgulanan proteomik uygulamaları örnekleyen önceki çalışmalarda numune hazırlama ve veri toplama konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışmanın bazı bölümleri IOS-1832968 KARİYER (P.N.’ye) ödül numarası altında Ulusal Bilim Vakfı, R35GM124755 ödül numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri (P.N.’ye), Maryland Üniversitesi-Ulusal Kanser Enstitüsü Ortaklık Programı (P.N.’ye) ve COSMOS Club Vakfı araştırma ödülleri (A.B.B. ve L.R.P.’ye) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Acetonitrile (LC-MS-grade) Fisher Scientific A955
Agarose ThermoFisher Scientific R0492
Ammonium bicarbonate Fisher Scientific A643-500
Analytical Column Thermo Scientific 164941
Analytical microbalance Mettler-Toledo XSE105DU
Automatic peptide fractionation platform Agilent 1260 Infinity II
Borosilicate Capillaries Sutter Instruments Co. B100-50-10
Borosilicate Capillaries (for making Emmitters) Sutter Instruments B100-75-10
C18 spin columns (for desalting) ThermoFisher Scientific 89870
Camera ro monitor electrospray Edmund Optics Inc. EO-2018C
Combretastatin A4 Millipore Sigma C7744
Commercial CESI system AB SCIEX CESI
(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS) VWR 97061-492
Cytochalasin D Millipore Sigma C8273
Dextran, Alexa Fluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable ThermoFisher Scientific D22910
Diothiothreitol Fisher Scientific FERR0861
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-30
EDTA Fisher Scientific AAJ62786AP
Epifluorescence light source Lumencore AURA III
Eppendorf LoBing microcentrifuge  tubes: protein Fisher Scientific 13-698-793
Formic acid (LC-MS-grade) Fisher Scientific A117-50
Freezer (-20 °C) Fisher Scientific 97-926-1 
Freezer (-80 °C) Thermo Scientific TSX40086A
Fused silica capillary Molex 1088150596
Heat Block Benchmark BSH300
High pressure liquid Chromatography System ThermoFisher Scientific Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem
High voltage power supply Spellman CZE1000R
High-resolution Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer
HPLC caps Thermo Scientific C4013-40A
HPLC Vials Thermo Scientific C4013-11
Illuminator e.g. Goosenecks Nikon C-FLED2
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen
Iodoacetamide Fisher Scientific AC122275000
Methanol (LC-MS-grade) Fisher Scientific A456
Methanol (LC-MS-grade) Fisher Scientific A456-4
Microcapillary puller Suttor Instruments P-2000
Microinjector Warner Instrument, Handem, CT PLI-100A
Micropippette puller Sutter Instruments Co. P-1000
MS data analysis software, commercial ProteomeDiscoverer
MS data analysis software, opensource MaxQuant
non-idet 40 substitute Millipore Sigma 11754599001
Petri dish 60 mm and 80 mm Fisher Scientific S08184
Pierce 10 µL bed Zip-tips (for desalting) ThermoFisher Scientific 87782
Pierce bicinchoninic acid protein assay kit ThermoFisher Scientific 23225
Pierce quantitative colorimetric peptide assay ThermoFisher Scientific 23275
Pierce Trypsin Protease (MS Grade) Fisher Scientific PI90058
Protein LoBind vials Eppendorf 0030108434
, 0030108442
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5430R
Refrigerated Incubator Thermo Scientific PR505755R/3721
sodium isethionate Millipore Sigma 220078
sodium pyrophosphate Sigma Aldrich 221368-100G
Stainless steel BGE vial Custom-Built
Stainless steel sample vials Custom-Built
Stereomicroscope (objective 10x) Nikon SMZ 1270, SZX18
Sucrose VWR 97063-790
Syringe pumps (2) Harvard Apparatus 704506
Syringes (gas-tight): 500–1000 µL Hamilton 1750TTL
Transfer pipettes (Plastic, disposable) Fisher Scientific 13-711-7M
Trap Column Thermo Scientific 164750
Tris-HCl (1 M solution) Fisher Scientific AAJ22638AP
Vacuum concentrator capable of operation at 4–10 °C Labconco 7310022
Vortex-mixer Benchmark BS-VM-1000
Water (LC-MS-grade) Fisher Scientific W6
Water (LC-MS-grade) Fisher Scientific W6
XYZ translation stage Thorlabs PT3
XYZ translation stage Custom-Built
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
  2. Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells and their secretome during in vitro differentiation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 612560 (2021).
  3. Christian, J. L. Morphogen gradients in development: From form to function. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 1 (1), 3-15 (2012).
  4. Gurdon, J. B., Elsdale, T. R., M, F. Sexually mature individuals of Xenopus laevis from the transplantation of single somatic nuclei. Nature. 182, 64-65 (1958).
  5. Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends in Genetics. 27 (12), 507-515 (2011).
  6. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. 发育生物学. 119 (2), 560-578 (1987).
  7. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. 发育生物学. 122 (2), 300-319 (1987).
  8. Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
  9. Sun, L. L., et al. Single cell proteomics using frog (Xenopus laevis) blastomeres isolated from early stage embryos, which form a geometric progression in protein content. Analytical Chemistry. 88 (13), 6653-6657 (2016).
  10. Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry for discovery proteomics: quantifying translational cell heterogeneity in the 16-cell frog (Xenopus) embryo. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (7), 2454-2458 (2016).
  11. Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chemical Reviews. 113 (4), 2343-2394 (2013).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , (2000).
  13. Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
  14. Gupta, M., Sonnett, M., Ryazanova, L., Presler, M., Wuhr, M., Vleminckx, K. Quantitative proteomics of xenopus embryos I, sample preparation. Xenopus. Methods in Molecular Biology. 1865, 175-194 (2018).
  15. Baxi, A. B., Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. Proteomic characterization of the neural ectoderm fated cell clones in the Xenopus laevis embryo by high-resolution mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 2064-2073 (2018).
  16. Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods in Molecular Biology. 135, 331-347 (2000).
  17. Sater, A. K., Moody, S. A. Using Xenopus to understand human diseases and developmental disorders. Genesis. 55 (1-2), 1-14 (2017).
  18. Lombard-Banek, C., Choi, S. B., Nemes, P., Allbritton, N. L., Kovarik, M. L. . Enzyme Activity in Single Cells. Methods in Enzymology. 628, 263-292 (2019).
  19. Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Nemes, P. High-sensitivity mass spectrometry for probing gene translation in single embryonic cells in the early frog (Xenopus) embryo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 11 (2016).
  20. Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. Microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (Xenopus laevis) embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56956 (2017).
  21. Lombard-Banek, C., Moody, S. A., Manzin, M. C., Nemes, P. Microsampling capillary electrophoresis mass spectrometry enables single-cell proteomics in complex tissues: developing cell clones in live Xenopus laevis and zebrafish embryos. Analytical Chemistry. 91 (7), 4797-4805 (2019).
  22. Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. 发育生物学. 120 (1), 299-304 (1987).
  23. Karimi, K., et al. Xenbase: a genomic, epigenomic and transcriptomic model organism database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 861-868 (2018).
  24. Kakebeen, A. D., Chitsazan, A. D., Wills, A. E. Tissue disaggregation and isolation of specific cell types from transgenic Xenopus appendages for transcriptional analysis by FACS. Developmental Dynamics. 250 (9), 1381-1392 (2021).
  25. Garcia, B. A. What does the future hold for top down mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 193-202 (2010).
  26. Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in top-down proteomics and the analysis of proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. (Palo Alto Calif). 9 (1), 499-519 (2016).
  27. Zhang, Z. B., Dubiak, K. M., Huber, P. W., Dovichi, N. J. Miniaturized filter-aided sample preparation (MICRO-FASP) method for high throughput, ultrasensitive proteomics sample preparation reveals proteome asymmetry in Xenopus laevis Embryos. Analytical Chemistry. 92 (7), 5554-5560 (2020).
  28. Wisniewski, J. R., Becher, D. . Microbial Proteomics: Methods and Protocols.Methods in Molecular Biology. 1841, 3-10 (2018).
  29. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  30. Zhu, Y., et al. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells. Nature Communications. 9, 882 (2018).
  31. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute-solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  32. Jiang, L., He, L., Fountoulakis, M. Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis. Journal of Chromatography A. 1023 (2), 317-320 (2004).
  33. Hildonen, S., Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Why less is more when generating tryptic peptides in bottom-up proteomics. Proteomics. 14 (17-18), 2031-2041 (2014).
  34. Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19, 161 (2018).
  35. Drouin, N., et al. Capillary electrophoresis-mass spectrometry at trial by metabo-ring: effective electrophoretic mobility for reproducible and robust compound annotation. Analytical Chemistry. 92 (20), 14103-14112 (2020).
  36. Sun, L. L., Zhu, G. J., Zhang, Z. B., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-generation electrokinetically pumped sheath-flow nanospray interface with improved stability and sensitivity for automated capillary zone electrophoresis-mass spectrometry analysis of complex proteome digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
  37. DeLaney, K., Sauer, C. S., Vu, N. Q., Li, L. J. Recent advances and new perspectives in capillary electrophoresis-mass spectrometry for single cell "omics". Molecules. 24 (1), 21 (2019).
  38. Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Protocols. 8 (4), 783-799 (2013).
  39. Choi, S. B., Zamarbide, M., Manzini, M. C., Nemes, P. Tapered-tip capillary electrophoresis nano-electrospray ionization mass spectrometry for ultrasensitive proteomics: the mouse cortex. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (4), 597-607 (2017).
  40. Pino, L. K., Rose, J., O’Broin, A., Shah, S., Schilling, B. Emerging mass spectrometry-based proteomics methodologies for novel biomedical applications. Biochemical Society Transactions. 48 (5), 1953-1966 (2020).
  41. Chen, C., Hou, J., Tanner, J. J., Cheng, J. L. Bioinformatics methods for mass spectrometry-based proteomics data analysis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 25 (2020).
  42. Peshkin, L., et al. On the relationship of protein and mRNA dynamics in vertebrate embryonic development. Developmental Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
  43. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  44. Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
  45. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  46. Mi, H. Y., et al. PANTHER version 16: a revised family classification, tree-based classification tool, enhancer regions and extensive api. Nucleic Acids Research. 49, 394-403 (2021).
  47. Schmidt, E., et al. . On the Move Federated Workshops. , 710-719 (2006).
  48. Deutsch, E. W., et al. Trans-Proteomic pipeline, a standardized data processing pipeline for large-scale reproducible proteomics informatics. Proteomics Clinical Applications. 9 (7-8), 745-754 (2015).
  49. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  50. Demsar, J., et al. Orange: Data mining toolbox in Python. Journal of Machine Learning Research. 14, 2349-2353 (2013).
  51. Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. Journal of Proteome Research. 8 (5), 2144-2156 (2009).
  52. Jensen, L. J., et al. STRING 8 – a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic Acids Research. 37, 412-416 (2009).
  53. Schweppe, D. K., Huttlin, E. L., Harper, J. W., Gygi, S. P. BioPlex display: an interactive suite for large-scale AP-MS protein-protein interaction data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 722-726 (2018).
  54. Hornbeck, P. V., et al. PhosphoSitePlus, 2014: mutations, PTMs and recalibrations. Nucleic Acids Research. 43, 512-520 (2015).
  55. Letunic, I., Khedkar, S., Bork, P. SMART: recent updates, new developments and status in 2020. Nucleic Acids Research. 49, 458-460 (2021).
  56. Lombard-Banek, C., et al. In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis). Angewandte Chemie-International Edition. 60 (23), 12852-12858 (2021).
  57. Lombard-Banek, C., Reddy, S., Moody, S. A., Nemes, P. Label-free quantification of proteins in single embryonic cells with neural fate in the cleavage-stage frog (Xenopus laevis) embryo using capillary electrophoresis electrospray ionization high-resolution mass spectrometry (CE-ESI-HRMS). Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2756-2768 (2016).
  58. Saha-Shah, A., et al. Single cell proteomics by data-independent acquisition to study embryonic asymmetry in Xenopus laevis. Analytical Chemistry. 91 (14), 8891-8899 (2019).
  59. Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Analytical Chemistry. 89 (13), 7069-7076 (2017).
  60. Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).

Tags

Artificial IntelligenceAI Writing AssistantContent GenerationCopywritingText GenerationContent Creation
check_url/cn/63586?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Baxi, A. B., Pade, L. R., Nemes, P. Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo. J. Vis. Exp. (182), e63586, doi:10.3791/63586 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image