Amplification d’Escherichia coli dans une puce microfluidique PCR à flux continu et sa détection à l’aide d’un système d’électrophorèse capillaire
Summary
Ce protocole décrit comment construire un système de chaîne polymérase à flux continu basé sur une puce microfluidique et comment construire un système d’électrophorèse capillaire en laboratoire. Il présente une méthode simple pour l’analyse des acides nucléiques en laboratoire.
Abstract
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une méthode traditionnelle utilisée pour l’amplification d’un gène cible qui a joué un rôle important dans le diagnostic biomoléculaire. Cependant, la PCR traditionnelle prend beaucoup de temps en raison de l’efficacité de la faible variation de température. Ce travail propose un système de PCR en flux continu (CF-PCR) basé sur une puce microfluidique. Le temps d’amplification peut être considérablement réduit en faisant passer la solution PCR dans un microcanal placé sur des réchauffeurs réglés à différentes températures. De plus, comme l’électrophorèse capillaire (EC) est un moyen idéal de différencier les produits de PCR positifs et faussement positifs, un système CE a été construit pour obtenir une séparation efficace des fragments d’ADN. Cet article décrit le processus d’amplification d’Escherichia coli (E. coli) par le système CF-PCR construit en interne et la détection des produits PCR par CE. Les résultats démontrent que le gène cible d’E. coli a été amplifié avec succès en 10 minutes, ce qui indique que ces deux systèmes peuvent être utilisés pour l’amplification et la détection rapides des acides nucléiques.
Introduction
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique de biologie moléculaire utilisée pour amplifier des fragments d’ADN spécifiques, amplifiant ainsi des traces d’ADN des centaines de millions de fois. Il a été largement utilisé dans le diagnostic clinique, la recherche médicale, la sécurité alimentaire, l’identité médico-légale et d’autres domaines. Le processus de PCR se compose principalement de trois étapes : la dénaturation à 90-95 °C, le recuit à 50-60 °C et l’extension à 72-77 °C. Le cycle thermique est une partie importante du processus de PCR ; cependant, le thermocycleur PCR traditionnel est non seulement encombrant mais aussi inefficace, nécessitant environ 40 minutes pour effectuer 25 cycles. Pour pallier ces limitations, un système de PCR à flux continu (CF-PCR) a été construit en interne, basé sur une puce microfluidique. La CF-PCR permet de gagner beaucoup de temps en conduisant la solution PCR dans des microcanaux placés sur des réchauffeurs à différentes températures 1,2,3,4,5.
Comme l’électrophorèse capillaire (EC) présente de nombreux avantages, tels qu’une haute résolution, une vitesse élevée et une excellente reproductibilité 6,7,8,9,10,11, elle est devenue un outil populaire en laboratoire pour l’analyse des acides nucléiques et des protéines. Cependant, la plupart des laboratoires, en particulier ceux des pays en développement, ne peuvent pas se permettre cette technologie en raison du prix élevé de l’instrument CE. Dans cet article, nous avons décrit les protocoles de fabrication de la puce microfluidique CF-PCR et de construction d’un système CE polyvalent en laboratoire. Nous démontrons également le processus d’amplification d’E. coli par ce système CF-PCR et la détection des produits PCR par le système CE. En suivant les procédures décrites dans ce protocole, les utilisateurs devraient être en mesure de fabriquer des puces microfluidiques, de préparer des solutions de PCR, de construire un système CF-PCR pour l’amplification des acides nucléiques et de mettre en place un système CE simple, même avec des ressources limitées, pour séparer les fragments d’ADN.
Protocol
Representative Results
Discussion
La PCR et l’EC sont deux biotechnologies populaires dans l’analyse des acides nucléiques. Cet article décrit l’amplification d’E. coli et la détection des produits PCR à l’aide des systèmes CF-PCR et CE, tous deux construits à l’interne. Le gène cible d’E. coli a été amplifié avec succès en 10 minutes en raison des taux de transfert de chaleur élevés. Les fragments d’ADN inférieurs à 1 500 pb ont été séparés en 8 minutes (Figure 5). Le gra…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Commission des sciences et de la technologie de la municipalité de Shanghai, en Chine (n° 19ZR1477500 et n° 18441900400). Nous remercions chaleureusement l’Université de Shanghai pour la science et la technologie (No.2017KJFZ049).
Materials
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
Referenzen
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