Amplificazione di Escherichia coli in un chip microfluidico PCR a flusso continuo e sua rilevazione con un sistema di elettroforesi capillare
Summary
Questo protocollo descrive come costruire un sistema a catena di polimerasi a flusso continuo basato su un chip microfluidico e come costruire un sistema di elettroforesi capillare in laboratorio. Presenta un metodo semplice per l’analisi degli acidi nucleici in laboratorio.
Abstract
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è un metodo tradizionale impiegato per l’amplificazione di un gene bersaglio che ha svolto un ruolo importante nella diagnostica biomolecolare. Tuttavia, la PCR tradizionale richiede molto tempo a causa dell’efficienza di variazione della bassa temperatura. Questo lavoro propone un sistema di PCR a flusso continuo (CF-PCR) basato su un chip microfluidico. Il tempo di amplificazione può essere notevolmente ridotto facendo scorrere la soluzione PCR in un microcanale posto su riscaldatori impostati a temperature diverse. Inoltre, poiché l’elettroforesi capillare (CE) è un modo ideale per differenziare i prodotti PCR positivi da quelli falsi positivi, è stato costruito un sistema CE per ottenere una separazione efficiente dei frammenti di DNA. Questo documento descrive il processo di amplificazione di Escherichia coli (E. coli) da parte del sistema CF-PCR costruito internamente e la rilevazione dei prodotti PCR da parte di CE. I risultati dimostrano che il gene bersaglio di E. coli è stato amplificato con successo entro 10 minuti, indicando che questi due sistemi possono essere utilizzati per la rapida amplificazione e rilevamento degli acidi nucleici.
Introduction
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica di biologia molecolare utilizzata per amplificare specifici frammenti di DNA, amplificando così tracce di DNA centinaia di milioni di volte. È stato ampiamente utilizzato nella diagnosi clinica, nella ricerca medica, nella sicurezza alimentare, nell’identificazione forense e in altri campi. Il processo di PCR consiste principalmente in tre fasi: denaturazione a 90-95 °C, ricottura a 50-60 °C ed estensione a 72-77 °C. Il ciclo termico è una parte importante del processo di PCR; tuttavia, il termociclatore PCR tradizionale non è solo ingombrante ma anche inefficiente, richiedendo circa 40 minuti per completare 25 cicli. Per superare queste limitazioni, è stato costruito internamente un sistema di PCR a flusso continuo (CF-PCR), basato su un chip microfluidico. La CF-PCR può far risparmiare molto tempo guidando la soluzione PCR in microcanali posti su riscaldatori a diverse temperature 1,2,3,4,5.
Poiché l’elettroforesi capillare (CE) presenta molti vantaggi, come l’alta risoluzione, l’alta velocità e l’eccellente riproducibilità 6,7,8,9,10,11, è diventata uno strumento popolare in laboratorio per l’analisi di acidi nucleici e proteine. Tuttavia, la maggior parte dei laboratori, in particolare i laboratori nei paesi in via di sviluppo, non possono permettersi questa tecnologia a causa del prezzo elevato dello strumento CE. In questo articolo, abbiamo delineato i protocolli su come fabbricare il chip microfluidico CF-PCR e su come costruire un sistema CE versatile in laboratorio. Dimostriamo anche il processo di amplificazione di E. coli da parte di questo sistema CF-PCR e la rilevazione dei prodotti PCR da parte del sistema CE. Seguendo le procedure descritte in questo protocollo, gli utenti dovrebbero essere in grado di fabbricare chip microfluidici, preparare soluzioni PCR, costruire un sistema CF-PCR per l’amplificazione degli acidi nucleici e impostare un semplice sistema CE, anche con risorse limitate, per separare i frammenti di DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sia la PCR che la CE sono due biotecnologie popolari nell’analisi degli acidi nucleici. Questo documento descrive l’amplificazione di E. coli e la rilevazione dei prodotti PCR utilizzando i sistemi CF-PCR e CE, entrambi costruiti internamente. Il gene bersaglio di E. coli è stato amplificato con successo entro 10 minuti a causa delle elevate velocità di trasferimento del calore. I frammenti di DNA più piccoli di 1.500 bp sono stati separati entro 8 minuti (Figura 5). Il …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Commissione per la Scienza e la Tecnologia della Municipalità di Shanghai, in Cina (n. 19ZR1477500 e n. 18441900400). Riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario dell’Università di Shanghai per la scienza e la tecnologia (No.2017KJFZ049).
Materials
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
Referenzen
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. Continuous-flow thermal gradient PCR. Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. Capillary Electrophoresis. Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
