Amplificación de Escherichia coli en un chip microfluídico de PCR de flujo continuo y su detección con un sistema de electroforesis capilar
Summary
Este protocolo describe cómo construir un sistema de cadena de polimerasa de flujo continuo basado en un chip microfluídico y cómo construir un sistema de electroforesis capilar en el laboratorio. Presenta un método sencillo para el análisis de ácidos nucleicos en el laboratorio.
Abstract
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método tradicional empleado para la amplificación de un gen diana que ha desempeñado un papel importante en el diagnóstico biomolecular. Sin embargo, la PCR tradicional requiere mucho tiempo debido a la eficiencia de la variación de baja temperatura. En este trabajo se propone un sistema de PCR de flujo continuo (CF-PCR) basado en un chip microfluídico. El tiempo de amplificación se puede reducir en gran medida ejecutando la solución de PCR en un microcanal colocado en calentadores configurados a diferentes temperaturas. Además, dado que la electroforesis capilar (CE) es una forma ideal de diferenciar los productos de PCR positivos y falsos positivos, se construyó un sistema de CE para lograr una separación eficiente de los fragmentos de ADN. En este trabajo se describe el proceso de amplificación de Escherichia coli (E. coli) mediante el sistema CF-PCR construido internamente y la detección de los productos de PCR mediante CE. Los resultados demuestran que el gen diana de E. coli se amplificó con éxito en 10 minutos, lo que indica que estos dos sistemas pueden utilizarse para la rápida amplificación y detección de ácidos nucleicos.
Introduction
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular utilizada para amplificar fragmentos específicos de ADN, amplificando así trazas de ADN cientos de millones de veces. Ha sido ampliamente utilizado en el diagnóstico clínico, la investigación médica, la seguridad alimentaria, la identificación forense y otros campos. El proceso de PCR consta principalmente de tres pasos: desnaturalización a 90-95 °C, recocido a 50-60 °C y extensión a 72-77 °C. El ciclo térmico es una parte importante del proceso de PCR; sin embargo, el termociclador de PCR tradicional no solo es voluminoso sino también ineficiente, ya que requiere aproximadamente 40 minutos para completar 25 ciclos. Para superar estas limitaciones, se construyó internamente un sistema de PCR de flujo continuo (CF-PCR), basado en un chip microfluídico. La CF-PCR puede ahorrar mucho tiempo al conducir la solución de PCR a microcanales colocados en calentadores a diferentes temperaturas 1,2,3,4,5.
Como la electroforesis capilar (CE) tiene muchas ventajas, como alta resolución, alta velocidad y excelente reproducibilidad 6,7,8,9,10,11, se ha convertido en una herramienta popular en el laboratorio para el análisis de ácidos nucleicos y proteínas. Sin embargo, la mayoría de los laboratorios, especialmente los laboratorios del mundo en desarrollo, no pueden permitirse esta tecnología debido al alto precio del instrumento CE. Aquí, hemos esbozado protocolos sobre cómo fabricar el chip microfluídico CF-PCR y cómo construir un sistema CE versátil en el laboratorio. También demostramos el proceso de amplificación de E. coli por este sistema CF-PCR y la detección de los productos de PCR por el sistema CE. Siguiendo los procedimientos descritos en este protocolo, los usuarios deberían ser capaces de fabricar chips microfluídicos, preparar soluciones de PCR, construir un sistema de CF-PCR para la amplificación de ácidos nucleicos y configurar un sistema de CE simple, incluso con recursos limitados, para separar fragmentos de ADN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tanto la PCR como la CE son dos biotecnologías populares en el análisis de ácidos nucleicos. En este trabajo se describe la amplificación de E. coli y la detección de los productos de PCR utilizando los sistemas CF-PCR y CE, ambos de fabricación propia. El gen diana de E. coli se amplificó con éxito en 10 minutos debido a las altas tasas de transferencia de calor. Los fragmentos de ADN menores de 1.500 pb se separaron en 8 minutos (Figura 5). La gran ventaja de esta…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de la Comisión de Ciencia y Tecnología de la Municipalidad de Shanghái, China (Nº 19ZR1477500 y Nº 18441900400). Agradecemos el apoyo financiero de la Universidad de Shanghái para la Ciencia y la Tecnología (No.2017KJFZ049).
Materials
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
Referenzen
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