הגברה של Escherichia coli בשבב מיקרופלואידי PCR בזרימה רציפה וגילויו באמצעות מערכת אלקטרופורזה נימית
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבנות מערכת שרשרת זרימה רציפה פולימראז המבוססת על שבב מיקרופלואידי וכיצד לבנות מערכת אלקטרופורזה נימית במעבדה. הוא מציג שיטה פשוטה לניתוח חומצות גרעין במעבדה.
Abstract
תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא שיטה מסורתית המשמשת להגברה של גן מטרה שמילא תפקיד חשוב באבחון ביומולקולרי. עם זאת, PCR מסורתי גוזל זמן רב בגלל יעילות השונות בטמפרטורה נמוכה. עבודה זו מציעה מערכת CONTINUOUS-FLOW-PCR (CF-PCR) המבוססת על שבב מיקרופלואידי. ניתן לקצר מאוד את זמן ההגברה על ידי הפעלת פתרון ה- PCR למיקרו-ערוץ הממוקם על תנורי חימום המוגדרים בטמפרטורות שונות. יתר על כן, מכיוון שאלקטרופורזה נימית (CE) היא דרך אידיאלית להבדיל בין מוצרי PCR חיוביים וחיוביים כוזבים, מערכת CE נבנתה כדי להשיג הפרדה יעילה של מקטעי ה- DNA. מאמר זה מתאר את תהליך ההגברה של Escherichia coli (E. coli) על ידי מערכת CF-PCR המובנית בתוך החברה ואת זיהוי מוצרי PCR על ידי CE. התוצאות מראות כי גן המטרה של E. coli הוגבר בהצלחה תוך 10 דקות, מה שמצביע על כך ששתי מערכות אלה יכולות לשמש להגברה מהירה וזיהוי של חומצות גרעין.
Introduction
תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא טכניקה ביולוגית מולקולרית המשמשת להגברת מקטעי DNA ספציפיים, ובכך מגבירה כמויות זעירות של DNA מאות מיליוני פעמים. הוא נמצא בשימוש נרחב באבחון קליני, מחקר רפואי, בטיחות מזון, זיהוי פורנזי ותחומים אחרים. תהליך ה- PCR מורכב בעיקר משלושה שלבים: דנטורציה ב 90-95 ° C, חישול ב 50-60 ° C, והרחבה ב 72-77 ° C. מחזור תרמי הוא חלק חשוב בתהליך ה- PCR; עם זאת, המחזור התרמי המסורתי PCR הוא לא רק מגושם אלא גם לא יעיל, ודורש כ -40 דקות כדי להשלים 25 מחזורים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, נבנתה בתוך החברה מערכת PCR (CF-PCR) בעלת זרימה רציפה, המבוססת על שבב מיקרופלואידי. CF-PCR יכול לחסוך זמן רב על ידי הנעת פתרון ה- PCR למיקרו-ערוצים הממוקמים על תנורי חימום בטמפרטורות שונות 1,2,3,4,5.
מכיוון שלאלקטרופורזה נימית (CE) יתרונות רבים, כגון רזולוציה גבוהה, מהירות גבוהה ויכולת שחזור מצוינת 6,7,8,9,10,11, היא הפכה לכלי פופולרי במעבדה לניתוח חומצות גרעין וחלבונים. עם זאת, רוב המעבדות, במיוחד מעבדות בעולם המתפתח, אינן יכולות להרשות לעצמן טכנולוגיה זו בגלל מחירו הגבוה של מכשיר CE. במאמר זה, תיארנו פרוטוקולים כיצד לייצר את השבב המיקרופלואידי CF-PCR וכיצד לבנות מערכת CE רב-תכליתית במעבדה. אנו גם מדגימים את תהליך ההגברה של E. coli על ידי מערכת CF-PCR זו ואת זיהוי מוצרי PCR על ידי מערכת CE. על ידי ביצוע ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה, משתמשים צריכים להיות מסוגלים לייצר שבבים מיקרופלואידים, להכין פתרונות PCR, לבנות מערכת CF-PCR להגברת חומצות גרעין, ולהקים מערכת CE פשוטה, אפילו עם משאבים מוגבלים, כדי להפריד מקטעי DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
הן PCR והן CE הן שתי ביוטכנולוגיות פופולריות בניתוח חומצות גרעין. מאמר זה מתאר את ההגברה של E. coli ואת זיהוי מוצרי PCR באמצעות מערכות CF-PCR ו- CE, שתיהן מובנות בתוך החברה. גן המטרה של E. coli הוגבר בהצלחה תוך 10 דקות בגלל קצבי העברת החום הגבוהים. מקטעי דנ”א קטנים מ-1,500 bp הופרדו תוך 8 דקות (<strong class="xfi…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי ועדת המדע והטכנולוגיה של עיריית שנחאי, סין (מס ’19ZR1477500 ומס ‘18441900400). אנו מודים בהכרת תודה על תמיכה כספית מאוניברסיטת שנחאי למדע וטכנולוגיה (No.2017KJFZ049).
Materials
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
Referenzen
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. Continuous-flow thermal gradient PCR. Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. Capillary Electrophoresis. Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
