Amplificação de Escherichia coli em um chip microfluídico de PCR em fluxo contínuo e sua detecção com um sistema de eletroforese capilar

Summary

Este protocolo descreve como construir um sistema de cadeia polimerase de fluxo contínuo baseado em um chip microfluídico e como construir um sistema de eletroforese capilar em laboratório. Apresenta um método simples para a análise de ácidos nucléicos em laboratório.

Abstract

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um método tradicional empregado para a amplificação de um gene alvo que tem desempenhado um papel importante no diagnóstico biomolecular. No entanto, a PCR tradicional é muito demorada devido à eficiência de variação de baixa temperatura. Este trabalho propõe um sistema de PCR em fluxo contínuo (CF-PCR) baseado em um chip microfluídico. O tempo de amplificação pode ser bastante reduzido executando a solução de PCR em um microcanal colocado em aquecedores ajustados a diferentes temperaturas. Além disso, como a eletroforese capilar (CE) é uma maneira ideal de diferenciar produtos de PCR positivos e falso-positivos, um sistema CE foi construído para obter uma separação eficiente dos fragmentos de DNA. Este trabalho descreve o processo de amplificação de Escherichia coli (E. coli) pelo sistema CF-PCR construído internamente e a detecção dos produtos de PCR por CE. Os resultados demonstram que o gene alvo de E. coli foi amplificado com sucesso dentro de 10 min, indicando que estes dois sistemas podem ser usados para a rápida amplificação e detecção de ácidos nucléicos.

Introduction

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica de biologia molecular usada para amplificar fragmentos específicos de DNA, amplificando assim traços de DNA centenas de milhões de vezes. Tem sido amplamente utilizado em diagnóstico clínico, pesquisa médica, segurança alimentar, identificação forense, e outros campos. O processo de PCR consiste principalmente de três etapas: desnaturação a 90-95 °C, anelamento a 50-60 °C e extensão a 72-77 °C. A ciclagem térmica é uma parte importante do processo de PCR; no entanto, o termociclador PCR tradicional não é apenas volumoso, mas também ineficiente, exigindo aproximadamente 40 min para completar 25 ciclos. Para superar essas limitações, um sistema de PCR de fluxo contínuo (CF-PCR) foi construído internamente, baseado em um chip microfluídico. A CF-PCR pode economizar muito tempo ao conduzir a solução de PCR em microcanais colocados em aquecedores em diferentes temperaturas 1,2,3,4,5.

Como a eletroforese capilar (CE) apresenta muitas vantagens, como alta resolução, alta velocidade e excelente reprodutibilidade6,7,8,9,10,11^, tornou-se uma ferramenta popular no laboratório para a análise de ácidos nucléicos e proteínas. No entanto, a maioria dos laboratórios, especialmente os laboratórios no mundo em desenvolvimento, não pode pagar esta tecnologia devido ao alto preço do instrumento CE. Aqui, descrevemos protocolos de como fabricar o chip microfluídico CF-PCR e como construir um sistema CE versátil no laboratório. Demonstramos também o processo de amplificação de E. coli por este sistema de CF-PCR e a detecção dos produtos de PCR pelo sistema CE. Seguindo os procedimentos descritos neste protocolo, os usuários devem ser capazes de fabricar chips microfluídicos, preparar soluções de PCR, construir um sistema de CF-PCR para amplificação de ácidos nucleicos e configurar um sistema CE simples, mesmo com recursos limitados, para separar fragmentos de DNA.

Protocol

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo. 1. Fabricação de chip microfluídico CF-PCR Aqueça o wafer de silicone a 200 °C durante 25 minutos para remover a humidade. Dispense 1 mL de fotorresistência SU-8-2075 por polegada de wafer. Gire no wafer de silício usando um revestidor de giro a 500 rpm para 5-10 s com uma aceleração de 100 rp…

Representative Results

A Figura 5 representa o eletroferograma dos produtos da PCR e os marcadores de DNA. O traço (Figura 5A) é o resultado CE do produto amplificado por CF-PCR, o traço (Figura 5B) é o resultado CE do produto amplificado pela ciclagem térmica e o traço (Figura 5C) é o resultado CE da escada de DNA de 100 pb. Primeiro, amplificamos o gene alvo de E. coli no sistema CF-PCR; a solução de PCR l…

Discussion

Tanto a PCR quanto a CE são duas biotecnologias populares na análise de ácidos nucléicos. Este trabalho descreve a amplificação de E. coli e a detecção dos produtos de PCR usando os sistemas CF-PCR e CE, ambos construídos internamente. O gene alvo de E. coli foi amplificado com sucesso dentro de 10 min devido às altas taxas de transferência de calor. Os fragmentos de DNA menores que 1.500 pb foram separados em 8 min (Figura 5). A grande vantagem dessas duas técn…

Materials

100 bp DNA ladder	Takara Bio Inc.	3422A
10x Fast Buffer I	Takara Bio Inc.	RR070A
10x TBE	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T1051
developer solution	Alfa Aesar, USA	L15459
dNTP mixture (2.5 μM)	Takara Bio Inc.	RR070A
EC-F	Sangon Biotech, Shanghai, China
EC-R	Sangon Biotech, Shanghai, China
HEC,1300K	Sigma-Aldrich, USA	9004-62-0
isopropanol	Aladdin, Shanghai, China	67-63-0
microscope	Olympus, Japan	BX51
photolithography	SUSS MicroTec, Germany	MJB4
photomultiplier tube	Hamamatsu Photonics, Japan	R928
photoresist	MicroChem, USA	SU-8 2075
PID temperature controllers	Shanghai, China	XH-W2023
plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G-2
polyvinyl pyrrolidone (PVP)	Aladdin, Shanghai, China	P110608
pump	Harvard Apparatus	PHD2000
silicone tubing	BIO-RAD,USA	7318210
solid-state relays	KZLTD, China	KS1-25LA
SpeedSTAR HS DNA Polymerase	Takara Bio Inc.	RR070A
steel needle	zhongxinqiheng,Suzhou,China
SYBR GREEN	Solarbio, Beijing, China	SY1020
temperature sensors	EasyShining Technology, Chengdu, China	TCM-M207
Template (E. coli)	Takara Bio Inc.	AK601
Tween 20	Aladdin, Shanghai, China	T104863
voltage power supply	Medina, NY, USA	TREK MODEL 610E