Escherichia coli'nin Sürekli Akış-PCR Mikroakışkan Çipinde Amplifikasyonu ve Kapiler Elektroforez Sistemi ile Tespiti
Summary
Bu protokol, bir mikroakışkan çipe dayalı bir sürekli akışlı polimeraz zincir sisteminin nasıl oluşturulacağını ve laboratuvarda bir kapiler elektroforez sisteminin nasıl oluşturulacağını açıklar. Laboratuvarda nükleik asitlerin analizi için basit bir yöntem sunar.
Abstract
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), biyomoleküler tanıda önemli bir rol oynayan bir hedef genin amplifikasyonu için kullanılan geleneksel bir yöntemdir. Bununla birlikte, geleneksel PCR, düşük sıcaklık varyasyon verimliliği nedeniyle çok zaman alıcıdır. Bu çalışma, mikroakışkan bir çipe dayalı bir sürekli akış-PCR (CF-PCR) sistemi önermektedir. Amplifikasyon süresi, PCR solüsyonunun farklı sıcaklıklara ayarlanmış ısıtıcılara yerleştirilen bir mikro kanala çalıştırılmasıyla büyük ölçüde azaltılabilir. Ayrıca, kapiler elektroforez (CE), pozitif ve yanlış pozitif PCR ürünlerini ayırt etmenin ideal bir yolu olduğundan, DNA fragmanlarının verimli bir şekilde ayrılmasını sağlamak için bir CE sistemi inşa edilmiştir. Bu makale, Escherichia coli’nin (E. coli) şirket içinde oluşturulan CF-PCR sistemi ile amplifikasyon sürecini ve PCR ürünlerinin CE ile tespitini açıklamaktadır. Sonuçlar, E. coli’nin hedef geninin 10 dakika içinde başarılı bir şekilde amplifiye edildiğini göstermektedir, bu da bu iki sistemin nükleik asitlerin hızlı amplifikasyonu ve tespiti için kullanılabileceğini göstermektedir.
Introduction
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), spesifik DNA fragmanlarını çoğaltmak için kullanılan bir moleküler biyoloji tekniğidir, böylece eser miktarda DNA’yı yüz milyonlarca kez çoğaltır. Klinik tanı, tıbbi araştırma, gıda güvenliği, adli kimlik tespiti ve diğer alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. PCR işlemi temel olarak üç adımdan oluşur: 90-95 °C’de denatürasyon, 50-60 °C’de tavlama ve 72-77 °C’de uzatma. Termal döngü, PCR sürecinin önemli bir parçasıdır; bununla birlikte, geleneksel PCR termal döngüleyici yalnızca hantal değil, aynı zamanda verimsizdir ve 25 döngüyü tamamlamak için yaklaşık 40 dakika gerektirir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, şirket içinde mikroakışkan bir çipe dayalı sürekli akışlı bir PCR (CF-PCR) sistemi kuruldu. CF-PCR, PCR solüsyonunu farklı sıcaklıklardaısıtıcılara yerleştirilen mikro kanallara sürerek zamandan büyük ölçüde tasarruf sağlayabilir 1,2,3,4,5.
Kapiler elektroforez (CE), yüksek çözünürlük, yüksek hız ve mükemmel tekrarlanabilirlik 6,7,8,9,10,11 gibi birçok avantaja sahip olduğundan, laboratuvarda nükleik asitlerin ve proteinlerin analizi için popüler bir araç haline gelmiştir. Bununla birlikte, çoğu laboratuvar, özellikle gelişmekte olan dünyadaki laboratuvarlar, CE cihazının yüksek fiyatı nedeniyle bu teknolojiyi karşılayamaz. Burada, CF-PCR mikroakışkan çipinin nasıl üretileceğine ve laboratuvarda çok yönlü bir CE sisteminin nasıl oluşturulacağına ilişkin protokolleri özetledik. Ayrıca, bu CF-PCR sistemi ile E. coli’nin amplifikasyon sürecini ve PCR ürünlerinin CE sistemi tarafından tespit edilmesini de gösteriyoruz. Bu protokolde açıklanan prosedürleri izleyerek, kullanıcılar mikroakışkan çipler üretebilmeli, PCR çözeltileri hazırlayabilmeli, nükleik asit amplifikasyonu için bir CF-PCR sistemi oluşturabilmeli ve DNA parçalarını ayırmak için sınırlı kaynaklarla bile basit bir CE sistemi kurabilmelidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hem PCR hem de CE, nükleik asitlerin analizinde iki popüler biyoteknolojidir. Bu makale, her ikisi de şirket içinde yerleşik olan CF-PCR ve CE sistemleri kullanılarak E. coli’nin amplifikasyonunu ve PCR ürünlerinin tespitini açıklamaktadır. E. coli’nin hedef geni, yüksek ısı transfer hızları nedeniyle 10 dakika içinde başarılı bir şekilde amplifiye edildi. 1.500 bp’den küçük DNA parçaları 8 dakika içinde ayrıldı (Şekil 5). Bu iki tekniğin en b…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin’in Şanghay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu tarafından desteklenmiştir (No. 19ZR1477500 ve No.18441900400). Şanghay Bilim ve Teknoloji Üniversitesi’nin (No.2017KJFZ049) mali desteğini minnetle kabul ediyoruz.
Materials
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
Referenzen
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. Continuous-flow thermal gradient PCR. Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. Capillary Electrophoresis. Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
