연속 유동 PCR 미세유체 칩에서 대장균 의 증폭 및 모세관 전기영동 시스템을 사용한 검출
Summary
이 프로토콜은 미세유체 칩을 기반으로 연속 유동 중합효소 사슬 시스템을 구축하는 방법과 실험실에서 모세관 전기영동 시스템을 구축하는 방법을 설명합니다. 실험실에서 핵산 분석을 위한 간단한 방법을 제시합니다.
Abstract
중합효소연쇄반응(PCR)은 생체 분자 진단에서 중요한 역할을 해온 표적 유전자의 증폭에 사용되는 전통적인 방법입니다. 그러나 기존 PCR은 저온 변이 효율로 인해 시간이 많이 걸립니다. 본 연구는 미세유체 칩을 기반으로 하는 연속유동 PCR(CF-PCR) 시스템을 제안한다. 증폭 시간은 PCR 용액을 다른 온도로 설정된 히터에 배치된 마이크로 채널로 실행하여 크게 줄일 수 있습니다. 또한 모세관 전기영동(CE)이 양성 및 위양성 PCR 산물을 구별하는 이상적인 방법이기 때문에 DNA 단편을 효율적으로 분리하기 위해 CE 시스템을 구축했습니다. 본 논문은 자체 제작한 CF-PCR 시스템에 의한 대장균 (E. coli)의 증폭 과정과 CE에 의한 PCR 산물의 검출 과정을 설명합니다. 결과는 대장균 의 표적 유전자가 10분 이내에 성공적으로 증폭되었음을 보여주며, 이는 이 두 시스템이 핵산의 신속한 증폭 및 검출에 사용될 수 있음을 나타냅니다.
Introduction
중합효소연쇄반응(PCR)은 특정 DNA 단편을 증폭하는 데 사용되는 분자 생물학 기술로, 미량의 DNA를 수억 번 증폭합니다. 임상 진단, 의학 연구, 식품 안전, 법의학 식별 및 기타 분야에서 널리 사용되었습니다. PCR 공정은 주로 90-95 °C에서 변성, 50-60 °C에서 어닐링, 72-77 °C에서 확장의 세 단계로 구성됩니다. 열 순환은 PCR 과정의 중요한 부분입니다; 그러나, 전통적인 PCR 열 순환기는 뿐만 아니라 부피가 크다, 또한 비효율적이어서, 25의 주기를 완료하는 데 대략 40 분이 요구한다. 이러한 한계를 극복하기 위해 미세유체 칩을 기반으로 하는 연속 흐름 PCR(CF-PCR) 시스템이 사내에 구축되었습니다. CF-PCR은 PCR 용액을 다른 온도 1,2,3,4,5에서 히터에 배치된 마이크로 채널로 구동하여 시간을 크게 절약할 수 있습니다.
모세관 전기영동(CE)은 고분해능, 고속 및 우수한 재현성 6,7,8,9,10,11과 같은 많은 장점이 있기 때문에 핵산 및 단백질 분석을 위한 실험실에서 널리 사용되는 도구가 되었습니다. 그러나 대부분의 실험실, 특히 개발 도상국의 실험실은 CE 기기의 높은 가격 때문에 이 기술을 감당할 수 없습니다. 여기에서는 CF-PCR 미세유체 칩을 제조하는 방법과 실험실에서 다용도 CE 시스템을 구축하는 방법에 대한 프로토콜을 간략하게 설명했습니다. 또한 이 CF-PCR 시스템에 의한 대장균 증폭 과정과 CE 시스템에 의한 PCR 산물 검출을 시연합니다. 이 프로토콜에 설명된 절차를 따르면 사용자는 미세유체 칩을 제조하고, PCR 용액을 준비하고, 핵산 증폭을 위한 CF-PCR 시스템을 구축하고, 제한된 리소스로도 간단한 CE 시스템을 설정하여 DNA 단편을 분리할 수 있어야 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
PCR과 CE는 모두 핵산 분석에서 널리 사용되는 두 가지 생명 공학입니다. 이 논문은 사내에 내장된 CF-PCR 및 CE 시스템을 사용하여 대장균 의 증폭과 PCR 산물의 검출에 대해 설명합니다. 대장균 의 표적 유전자는 높은 열 전달 속도 덕분에 10분 이내에 성공적으로 증폭되었습니다. 1,500bp보다 작은 DNA 단편은 8분 이내에 분리되었습니다(그림 5). 이 2개의 기술의 중대?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 상하이시 과학기술위원회(No. 19ZR1477500 및 No.18441900400)의 지원을 받았습니다. 상하이 과학 기술 대학 (No.2017KJFZ049)의 재정 지원에 감사드립니다.
Materials
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
Referenzen
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