Amplifikation von Escherichia coli in einem Continuous-Flow-PCR-Mikrofluidik-Chip und deren Detektion mit einem Kapillarelektrophorese-System
Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie man ein Continuous-Flow-Polymerase-Kettensystem auf der Basis eines Mikrofluidik-Chips aufbaut und wie man ein Kapillarelektrophoresesystem im Labor aufbaut. Es stellt eine einfache Methode für die Analyse von Nukleinsäuren im Labor vor.
Abstract
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine traditionelle Methode zur Amplifikation eines Zielgens, die in der biomolekularen Diagnostik eine wichtige Rolle gespielt hat. Die herkömmliche PCR ist jedoch aufgrund der Effizienz bei niedrigen Temperaturschwankungen sehr zeitaufwändig. In dieser Arbeit wird ein Continuous-Flow-PCR (CF-PCR)-System vorgeschlagen, das auf einem mikrofluidischen Chip basiert. Die Amplifikationszeit kann stark verkürzt werden, indem die PCR-Lösung in einen Mikrokanal geleitet wird, der auf Heizgeräten mit unterschiedlichen Temperaturen platziert ist. Da die Kapillarelektrophorese (CE) ein idealer Weg zur Unterscheidung von positiven und falsch-positiven PCR-Produkten ist, wurde ein CE-System entwickelt, um eine effiziente Trennung der DNA-Fragmente zu erreichen. In dieser Arbeit wird der Prozess der Amplifikation von Escherichia coli (E. coli) durch das hauseigene CF-PCR-System und der Nachweis der PCR-Produkte durch CE beschrieben. Die Ergebnisse zeigen, dass das Zielgen von E. coli innerhalb von 10 Minuten erfolgreich amplifiziert wurde, was darauf hindeutet, dass diese beiden Systeme für die schnelle Amplifikation und den Nachweis von Nukleinsäuren verwendet werden können.
Introduction
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine molekularbiologische Technik, die zur Amplifikation spezifischer DNA-Fragmente verwendet wird, wodurch Spuren von DNA hundertmillionenfach vervielfältigt werden. Es wurde häufig in der klinischen Diagnose, der medizinischen Forschung, der Lebensmittelsicherheit, der forensischen Identifizierung und anderen Bereichen eingesetzt. Der PCR-Prozess besteht im Wesentlichen aus drei Schritten: Denaturierung bei 90-95 °C, Glühen bei 50-60 °C und Verlängerung bei 72-77 °C. Thermozyklen sind ein wichtiger Bestandteil des PCR-Prozesses. Der herkömmliche PCR-Thermocycler ist jedoch nicht nur sperrig, sondern auch ineffizient und benötigt etwa 40 Minuten, um 25 Zyklen abzuschließen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde im eigenen Haus ein Continuous-Flow-PCR-System (CF-PCR) entwickelt, das auf einem Mikrofluidik-Chip basiert. Die CF-PCR kann erheblich Zeit sparen, indem die PCR-Lösung in Mikrokanäle getrieben wird, die bei unterschiedlichen Temperaturenauf Heizgeräten platziert werden 1,2,3,4,5.
Da die Kapillarelektrophorese (CE) viele Vorteile hat, wie z. B. hohe Auflösung, hohe Geschwindigkeit und hervorragende Reproduzierbarkeit 6,7,8,9,10,11, ist sie zu einem beliebten Werkzeug im Labor für die Analyse von Nukleinsäuren und Proteinen geworden. Die meisten Labore, insbesondere Labore in Entwicklungsländern, können sich diese Technologie jedoch aufgrund des hohen Preises des CE-Instruments nicht leisten. Hier haben wir Protokolle für die Herstellung des CF-PCR-Mikrofluidik-Chips und den Aufbau eines vielseitigen CE-Systems im Labor skizziert. Wir demonstrieren auch den Prozess der Amplifikation von E. coli durch dieses CF-PCR-System und den Nachweis der PCR-Produkte durch das CE-System. Durch die Befolgung der in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren sollten Benutzer in der Lage sein, mikrofluidische Chips herzustellen, PCR-Lösungen herzustellen, ein CF-PCR-System für die Nukleinsäureamplifikation aufzubauen und ein einfaches CE-System einzurichten, auch mit begrenzten Ressourcen, um DNA-Fragmente zu trennen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sowohl PCR als auch CE sind zwei beliebte Biotechnologien in der Analyse von Nukleinsäuren. Dieser Artikel beschreibt die Amplifikation von E. coli und den Nachweis der PCR-Produkte mit den CF-PCR- und CE-Systemen, die beide im eigenen Haus entwickelt wurden. Das Zielgen von E. coli wurde aufgrund der hohen Wärmeübertragungsraten innerhalb von 10 min erfolgreich amplifiziert. Die DNA-Fragmente, die kleiner als 1.500 bp waren, wurden innerhalb von 8 Minuten getrennt (Abbildung 5</…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Wissenschafts- und Technologiekommission der Stadtverwaltung Shanghai, China, unterstützt (Nr. 19ZR1477500 und Nr. 18441900400). Wir bedanken uns für die finanzielle Unterstützung durch die University of Shanghai for Science and Technology (Nr.2017KJFZ049).
Materials
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
Referenzen
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