تتبع إطلاق miRNA في الحويصلات خارج الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي
Summary
هنا ، نصف بروتوكولا مباشرا يتيح التقييم في المختبر لوفرة الحمض النووي الريبي الميكروي المسمى بالفلورسنت لدراسة ديناميكيات تغليف microRNA وتصديره إلى حويصلات خارج الخلية (EVs).
Abstract
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي وسطاء مهمون للاتصال الخلوي الذي تفرزه مجموعة متنوعة من الخلايا المختلفة. تنقل هذه المركبات الكهربائية الجزيئات النشطة بيولوجيا ، بما في ذلك البروتينات والدهون والأحماض النووية (الحمض النووي ، والحمض النووي الريبي المرسال ، والحمض النووي الريبي الدقيق ، وغيرها من الحمض النووي الريبي غير المشفر) ، من خلية إلى أخرى ، مما يؤدي إلى عواقب النمط الظاهري في الخلايا المتلقية. من بين جميع شحنات EV المختلفة ، حظيت microRNAs (miRNAs) بقدر كبير من الاهتمام لدورها في تشكيل البيئة المكروية وفي تثقيف الخلايا المتلقية بسبب عدم تنظيمها الواضح ووفرة في المركبات الكهربائية. تشير البيانات الإضافية إلى أن العديد من miRNAs يتم تحميلها بنشاط في المركبات الكهربائية. على الرغم من هذا الدليل الواضح ، فإن البحث عن ديناميكيات التصدير وآليات فرز miRNA محدود. هنا ، نقدم بروتوكولا باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي ل EV-miRNA والذي يمكن استخدامه لفهم ديناميكيات تحميل EV-miRNA وتحديد الآلات المشاركة في تصدير miRNA. في هذا البروتوكول ، يتم اقتران miRNAs المحددة مسبقا ليتم تخصيبها في EVs واستنفادها من الخلايا المانحة إلى فلوروفور ونقلها إلى الخلايا المانحة. ثم يتم التحقق من miRNAs الموسومة بالفلورسنت للتحميل في EVs والنضوب من الخلايا باستخدام qRT-PCR. كعنصر تحكم في النقل وأداة لبوابة السكان المنقولين من الخلايا ، يتم تضمين الحمض النووي الريبي الخلوي المسمى بالفلورسنت (الخلايا المحتفظ بها والمستنفدة EV). يتم تقييم الخلايا المنقولة مع كل من EV-miRNA والخلية المحتفظ بها miRNA لإشارات الفلورسنت على مدار 72 ساعة. تتضاءل شدة إشارة التألق الخاصة ب EV-miRNAs بسرعة مقارنة بالحمض النووي الريبي المرسال المحتفظ به بالخلية. باستخدام هذا البروتوكول المباشر ، يمكن للمرء الآن تقييم ديناميكيات تحميل miRNA وتحديد العوامل المختلفة المسؤولة عن تحميل miRNAs في المركبات الكهربائية.
Introduction
تعد MicroRNAs (miRNAs) واحدة من أفضل المجموعات الفرعية المميزة للحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر ، والمعروفة بدورها الحاسم في تنظيم الجينات بعد النسخ. يتبع التعبير والتكوين الحيوي لمعظم miRNAs سلسلة منسقة من الأحداث التي تبدأ بنسخ miRNAs الأولية (pri-miRNAs) في النواة. بعد المعالجة النووية بواسطة مجمع المعالجات الدقيقة إلى سلائف miRNAs (pre-miRNAs) ، يتم تصدير ما قبل miRNAs إلى السيتوبلازم ، حيث تخضع لمزيد من المعالجة بواسطة RNase III endonuclease ، dicer إلى 21-23 نيوكليوتيدات ناضجة miRNAدوبلكس 1. يرتبط أحد خيوط miRNA الناضجة المعالجة بالحمض النووي الريبي المرسال المستهدف (mRNAs) ، مما يؤدي إلى تدهور أو قمع متعدية للأهداف2. استنادا إلى الدور متعدد الخواص ل miRNAs في تنظيم العديد من mRNAs المستهدفة المتنوعة في وقت واحد ، فليس من المستغرب أن يتم تنظيم تعبير miRNA بإحكام3. في الواقع ، يساهم التعبير غير المناسب في حالات مرضية مختلفة ، خاصة في السرطان. لا يمثل التعبير الشاذ عن miRNAs توقيعا خاصا بالمرض فحسب ، بل ظهر أيضا كهدف للإمكانات النذير والعلاجية4،5،6. بالإضافة إلى أدوارها داخل الخلايا ، فإن miRNAs لها أيضا أدوار غير مستقلة. على سبيل المثال ، يمكن تعبئة miRNAs بشكل انتقائي في EVs بواسطة الخلايا المانحة وتصديرها إلى المواقع المتلقية حيث تثير استجابات مظهرية متنوعة في علم وظائف الأعضاء الطبيعي والمرض7،8،9.
على الرغم من الأدلة الواضحة على أن miRNAs المرتبطة ب EV هي جزيئات حيوية وظيفية ، إلا أنه ليس من المفهوم تماما كيف يتم تنظيم مجموعات فرعية معينة من miRNAs في حالات المرض مثل السرطان وكيف تختار الآلية الخلوية وفرز miRNAs إلى Evs10,11. بالنظر إلى الدور المحتمل ل EV-miRNAs في تعديل البيئة المكروية ، من الأهمية بمكان تحديد الآليات التي ينطوي عليها تصدير miRNAs المختارة لتوضيح دور المركبات الكهربائية بشكل كامل في الاتصال بين الخلايا والتسبب في المرض. إن فهم عملية إطلاق miRNA في المركبات الكهربائية لن يسلط الضوء على الوسطاء المهمين لتصدير miRNA فحسب ، بل يمكن أن يوفر أيضا رؤى حول العلاجات المحتملة. لتحقيق هذا المستوى من المعرفة ، يجب تكييف الأدوات لمعالجة هذه الأسئلة التجريبية الجديدة بأمانة. في الواقع ، تنمو الدراسات التي تقيم المركبات الكهربائية بشكل كبير بسبب إدخال تقنيات وضوابط جديدة12,13. فيما يتعلق بتقييم وفرة miRNAs المصدرة إلى EVs ، كان تسلسل الجيل التالي وتفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR) هي الأدوات القياسية الحالية. في حين أن هذه الأدوات مفيدة لتقييم وفرة miRNAs في المركبات الكهربائية ، إلا أن هناك قيودا على حساسيتها وخصوصيتها ، واستخدام هذه الأساليب الثابتة لتقييم الديناميكيات غير كاف. يتطلب تحديد ديناميكيات تصدير miRNA إلى المركبات الكهربائية مجموعة من الأدوات المتخصصة. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا باستخدام miRNAs المترافقة بالفلورسنت ، لتحليل ديناميكيات إطلاق miRNA من الخلايا المانحة ودمجها في EVs. نناقش أيضا مزايا وقيود الطريقة ونقدم توصيات للاستخدام الأمثل. ستكون الطريقة متعددة الاستخدامات المقدمة في هذه الورقة مفيدة للباحثين المهتمين بدراسة إطلاق miRNA في المركبات الكهربائية وأدوارها المحتملة في الاتصالات الخلوية والمرض.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتيح البروتوكول الذي تم إنشاؤه حديثا التقاط حركية إطلاق miRNA في المركبات الكهربائية بعد نقل EV-miRNAs. يسمح هذا النهج بالتحليل المتزامن للعديد من EV-miRNAs و cell-miRNAs ، وفقا لقدرات مقياس الخلايا. علاوة على ذلك ، في حين أن تحليل قياس التدفق الخلوي يمكن أن يوفر رؤى قيمة في بيولوجيا EV miRNA ، إلا أنه لا يخلو ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدر الدعم والمشورة من الدكتورة جيل هاتشكروفت ، مديرة المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي في جامعة بوردو. تم دعم هذا العمل من قبل R01CA226259 و R01CA205420 إلى A.L.K. ، وجائزة الابتكار من جمعية الرئة الأمريكية (ANALA2023) IA-1059916 إلى ALK ، ومنحة Purdue Shared Resources Facility P30CA023168 ، ومنحة فولبرايت للدكتوراه الرائدة التي منحتها وزارة الخارجية بالولايات المتحدة الأمريكية إلى H.H.H.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
Referencias
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
