מעקב אחר שחרור miRNA לתוך שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות ציטומטריית זרימה
Summary
במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט המאפשר הערכה חוץ גופית של שפע המיקרו-רנ”א המסומן באופן פלואורסצנטי כדי לחקור את הדינמיקה של אריזות מיקרו-רנ”א ולייצא לשלפוחיות חוץ-תאיות (EV).
Abstract
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן מתווכות חשובות של תקשורת תאית המופרשות על-ידי מגוון תאים שונים. כלי רכב חשמליים אלה מעבירים מולקולות ביו-אקטיביות, כולל חלבונים, שומנים וחומצות גרעין (דנ”א, mRNAs, מיקרו-רנ”א ורנ”א לא מקודד אחר), מתא אחד למשנהו, מה שמוביל לתוצאות פנוטיפיות בתאים המקבלים. מכל מטעני הרכב החשמליים השונים, מיקרו-רנ”א (miRNAs) זכו לתשומת לב רבה בשל תפקידם בעיצוב המיקרו-סביבה ובחינוך התאים המקבלים בשל חוסר הוויסות הברור שלהם והשפע שלהם ברכב חשמלי. נתונים נוספים מצביעים על כך שהרבה miRNA נטענים באופן פעיל לתוך כלי רכב חשמליים. למרות ראיות ברורות אלה, המחקר על הדינמיקה של הייצוא ומנגנוני מיון miRNA מוגבל. כאן, אנו מספקים פרוטוקול באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה של EV-miRNA שניתן להשתמש בו כדי להבין את הדינמיקה של טעינת EV-miRNA ולזהות את המכונות המעורבות בייצוא miRNA. בפרוטוקול זה, miRNA שנקבע מראש כי הוא מועשר ברכבים חשמליים ומדולדל מתאי התורם מצומד לפלואורופור ומוזרם לתאי התורם. לאחר מכן, ה-miRNA המתויגים באופן פלואורסצנטי מאומתים לטעינה לרכבים חשמליים ולהתרוקנות מתאים באמצעות qRT-PCR. הן כבקרת טרנספקציה והן ככלי לנטרול אוכלוסיית התאים הנגועים, נכלל רנ”א תאי עם תווית פלואורסצנטית (תאים שמורים ומרוקנים מ-EV). תאים הנגועים הן ב-EV-miRNA והן ב-miRNA שנשמר בתאים מוערכים לאותות פלואורסצנטיים במהלך 72 שעות. עוצמת האות הפלואורסצנטי הספציפית ל-EV-miRNA פוחתת במהירות בהשוואה ל-miRNA השמור בתאים. באמצעות פרוטוקול פשוט זה, ניתן כעת להעריך את הדינמיקה של טעינת miRNA ולזהות גורמים שונים האחראים לטעינת miRNA לתוך כלי רכב חשמליים.
Introduction
מיקרו-רנ”א (miRNAs) הוא אחת מתת-הקבוצות המאופיינות ביותר של רנ”א קטן שאינו מקודד, הידועות בתפקידן הקריטי בוויסות גנים לאחר שעתוק. הביטוי והביוגנזה של רוב ה-miRNAs עוקבים אחר סדרה מתואמת של אירועים שמתחילה בשעתוק של ה-miRNA הראשוני (pri-miRNAs) בגרעין. לאחר עיבוד גרעיני על ידי קומפלקס המיקרו-מעבדים לתוך precursor-miRNA (pre-miRNAs), pre-miRNAs מיוצאים לציטופלסמה, שם הם עוברים עיבוד נוסף על ידי אנדונוקלאז RNase III, dicer לתוך 21-23 נוקלאוטיד בוגר miRNA דופלקסים1. אחד הגדילים של ה-miRNA הבוגר המעובד נקשר ל-mRNA שליח המטרה (mRNAs), מה שמוביל לפירוק או לדיכוי תרגומי של המטרות2. בהתבסס על התפקיד הפליוטרופי של miRNAs בוויסות סימולטני של מספר mRNA מטרות מגוונות, אין זה מפתיע שביטוי miRNA מווסת היטב3. אכן, ביטוי לא הולם תורם למצבי מחלה שונים, במיוחד בסרטן. הביטוי החריג של miRNAs לא רק מייצג חתימה ספציפית למחלה, אלא גם התגלה כיעד לפוטנציאל פרוגנוסטי וטיפולי 4,5,6. בנוסף לתפקידים התוך-תאיים שלהם, ל-miRNA יש גם תפקידים לא אוטונומיים. לדוגמה, miRNA יכול להיות ארוז באופן סלקטיבי לתוך EVs על ידי תאים תורמים ולייצא לאתרים מושתלים, שם הם מעוררים תגובות פנוטיפיות מגוונות בפיזיולוגיה נורמלית ומחלות 7,8,9.
למרות ראיות ברורות לכך ש-miRNA הקשור לרכב חשמלי הוא ביומולקולות פונקציונליות, לא לגמרי מובן כיצד תת-קבוצות ספציפיות של miRNA אינן מווסתות במצבי מחלה כגון סרטן, וכיצד מנגנון תאי בוחר וממיין miRNA ל-Evs10,11. בהתחשב בתפקיד הפוטנציאלי של EV-miRNA בוויסות המיקרו-סביבה, חיוני לזהות את המנגנונים המעורבים בייצוא miRNA נבחרים כדי להבהיר באופן מלא את תפקידם של כלי רכב חשמליים בתקשורת בין-תאית ובפתוגנזה של מחלות. הבנת תהליך שחרור miRNA לרכבים חשמליים לא רק תדגיש מתווכים חשובים של ייצוא miRNA, אלא גם יכולה לספק תובנות לגבי טיפולים פוטנציאליים. כדי להשיג רמה זו של ידע, יש להתאים כלים כדי לענות נאמנה על שאלות ניסוייות חדשות אלה. ואכן, מחקרים המעריכים כלי רכב חשמליים גדלים באופן אקספוננציאלי עקב הכנסת טכניקות ובקרות חדשות12,13. ביחס להערכת השפע של miRNA מיוצא לכלי רכב חשמליים, ריצוף הדור הבא ותגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק לאחור (qRT-PCR) היו הכלים הסטנדרטיים הנוכחיים. בעוד שכלים אלה שימושיים להערכת שפע ה-miRNA ברכבים חשמליים, יש מגבלות לרגישות ולספציפיות שלהם, והשימוש בגישות סטטיות אלה להערכת דינמיקה אינו מספיק. הגדרת הדינמיקה של ייצוא miRNA לרכבים חשמליים דורשת שילוב של כלים מיוחדים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף באמצעות miRNA מצומד פלואורסצנטית, כדי לנתח את הדינמיקה של שחרור miRNA מתאי תורם ושילוב לתוך EVs. כמו כן, אנו דנים ביתרונות ובמגבלות השיטה ומספקים המלצות לשימוש מיטבי. השיטה הרב-תכליתית המוצגת במאמר זה תהיה שימושית לחוקרים המעוניינים לחקור שחרור miRNA לרכבים חשמליים ואת תפקידם הפוטנציאלי בתקשורת תאית ובמחלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול החדש שהוקם מאפשר לכידת קינטיקה של שחרור miRNA לרכבים חשמליים לאחר טרנספקציה של EV-miRNAs. הגישה מאפשרת ניתוח סימולטני של מספר רב של EV-miRNA ו-cell-miRNAs, בכפוף ליכולות הציטומטר. יתר על כן, בעוד ניתוח ציטומטריית זרימה יכול לספק תובנות חשובות על ביולוגיה miRNA EV, זה לא בלי מגבלות. אם כי ניתן להתגבר ע…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בתמיכה ובייעוץ מד”ר ג’יל האצ’קרופט, מנהלת מתקן הליבה של Flow Cytometry באוניברסיטת Purdue. עבודה זו נתמכה על ידי R01CA226259 ו- R01CA205420 ל- A.L.K., פרס חדשנות של איגוד הריאות האמריקאי (ANALA2023) IA-1059916 ל- A.L.K., מענק מתקן משאבים משותפים של Purdue P30CA023168, ומלגת דגל פולברייט לדוקטורט שהוענקה על ידי מחלקת המדינה, ארה”ב ל- H.H.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
Referencias
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
