Volgen van miRNA-afgifte in extracellulaire blaasjes met behulp van flowcytometrie
Summary
Hier beschrijven we een eenvoudig protocol dat in vitro beoordeling van de overvloed aan fluorescerend gelabelde microRNA’s mogelijk maakt om de dynamiek van microRNA-verpakking en export naar extracellulaire vesikels (EV’s) te bestuderen.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EV’s) zijn belangrijke mediatoren van cellulaire communicatie die worden uitgescheiden door een verscheidenheid aan verschillende cellen. Deze EV’s transporteren bioactieve moleculen, waaronder eiwitten, lipiden en nucleïnezuren (DNA, mRNA’s, microRNA’s en andere niet-coderende RNA’s), van de ene cel naar de andere, wat leidt tot fenotypische gevolgen in de ontvangende cellen. Van alle verschillende EV-ladingen hebben microRNA’s (miRNA’s) veel aandacht gekregen voor hun rol bij het vormgeven van de micro-omgeving en bij het opleiden van ontvangende cellen vanwege hun duidelijke ontregeling en overvloed aan EV’s. Aanvullende gegevens geven aan dat veel miRNA’s actief in EV’s worden geladen. Ondanks dit duidelijke bewijs is het onderzoek naar de dynamiek van export en mechanismen van miRNA-sortering beperkt. Hier bieden we een protocol met behulp van flowcytometrie-analyse van EV-miRNA dat kan worden gebruikt om de dynamiek van EV-miRNA-belasting te begrijpen en de mechanismen te identificeren die betrokken zijn bij miRNA-export. In dit protocol worden miRNA’s waarvan vooraf is bepaald dat ze worden verrijkt in EV’s en uitgeput uit donorcellen, geconjugeerd tot een fluorofoor en getransfecteerd in de donorcellen. De fluorescerend gelabelde miRNA’s worden vervolgens geverifieerd voor het laden in EV’s en uitputting van cellen met behulp van qRT-PCR. Als zowel een transfectiecontrole als een hulpmiddel voor het afschermen van de getransfecteerde populatie van cellen, is een fluorescerend gelabeld cellulair RNA (celbehouden en EV-verarmd) opgenomen. Cellen die zijn getransfecteerd met zowel het EV-miRNA als het celvastgehouden miRNA worden in de loop van 72 uur geëvalueerd op fluorescerende signalen. De intensiteit van het fluorescentiesignaal die specifiek is voor de EV-miRNA’s neemt snel af in vergelijking met het door de cel behouden miRNA. Met behulp van dit eenvoudige protocol kan men nu de dynamiek van het laden van miRNA beoordelen en verschillende factoren identificeren die verantwoordelijk zijn voor het laden van miRNA’s in EV’s.
Introduction
MicroRNA’s (miRNA’s) zijn een van de best gekarakteriseerde subsets van kleine niet-coderende RNA’s, die bekend staan om hun cruciale rol in posttranscriptionele genregulatie. De expressie en biogenese van de meeste miRNA’s volgen een gecoördineerde reeks gebeurtenissen die begint met transcriptie van de primaire miRNA’s (pri-miRNA’s) in de kern. Na nucleaire verwerking door het microprocessorcomplex tot precursor-miRNA’s (pre-miRNA’s), worden de pre-miRNA’s geëxporteerd naar het cytoplasma, waar ze verdere verwerking ondergaan door het RNase III-endonuclease, dat wordt omgesneden tot 21-23 nucleotiderijpe miRNA-duplexen1. Een van de strengen van het verwerkte rijpe miRNA bindt zich aan doelboodschapper-RNA’s (mRNA’s), wat leidt tot degradatie of translationele onderdrukking van de doelwitten2. Op basis van de pleiotrope rol van miRNA’s bij het gelijktijdig reguleren van meerdere diverse doel-mRNA’s, is het niet verwonderlijk dat de expressie van miRNA strak wordt gereguleerd3. Ongepaste expressie draagt inderdaad bij aan verschillende ziektetoestanden, vooral bij kanker. De afwijkende expressie van miRNA’s vertegenwoordigt niet alleen een ziektespecifieke signatuur, maar is ook naar voren gekomen als een doelwit voor prognostisch en therapeutisch potentieel 4,5,6. Naast hun intracellulaire rollen hebben miRNA’s ook niet-autonome rollen. MiRNA’s kunnen bijvoorbeeld selectief door donorcellen in EV’s worden verpakt en worden geëxporteerd naar ontvangende locaties waar ze verschillende fenotypische reacties opwekken in de normale en ziektefysiologie 7,8,9.
Ondanks duidelijk bewijs dat EV-geassocieerde miRNA’s functionele biomoleculen zijn, is het niet volledig duidelijk hoe specifieke subsets van miRNA’s worden ontregeld in ziektetoestanden zoals kanker en hoe cellulaire machinerie miRNA’s selecteert en sorteert in Evs10,11. Gezien de potentiële rol van EV-miRNA’s bij het moduleren van de micro-omgeving, is het van cruciaal belang om de mechanismen te identificeren die betrokken zijn bij de export van geselecteerde miRNA’s om de rol van EV’s in intercellulaire communicatie en ziektepathogenese volledig op te helderen. Inzicht in het proces van miRNA-afgifte in EV’s zal niet alleen belangrijke mediatoren van miRNA-export aan het licht brengen, maar kan ook inzicht geven in potentiële therapieën. Om dit kennisniveau te bereiken, moeten instrumenten worden aangepast om deze nieuwe experimentele vragen getrouw te beantwoorden. Studies die EV’s evalueren, groeien exponentieel als gevolg van de introductie van nieuwe technieken en controles 12,13. Met betrekking tot het evalueren van de overvloed aan geëxporteerde miRNA’s in EV’s, zijn sequencing van de volgende generatie en kwantitatieve reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) de huidige standaardinstrumenten. Hoewel deze instrumenten nuttig zijn voor het evalueren van de overvloed aan miRNA’s in EV’s, zijn er beperkingen aan hun gevoeligheid en specificiteit, en het gebruik van deze statische benaderingen voor het evalueren van dynamiek is onvoldoende. Het definiëren van de dynamiek van miRNA-export naar EV’s vereist een combinatie van gespecialiseerde tools. Hier presenteren we een uitgebreid protocol met behulp van fluorescerend geconjugeerde miRNA’s, om de dynamiek van de afgifte van miRNA uit donorcellen en de opname in EV’s te analyseren. Ook bespreken we de voordelen en beperkingen van de methode en geven we aanbevelingen voor optimaal gebruik. De veelzijdige methode die in dit artikel wordt gepresenteerd, zal nuttig zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van miRNA-afgifte in EV’s en hun mogelijke rol in cellulaire communicatie en ziekte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het nieuw opgestelde protocol maakt het mogelijk om de kinetiek van miRNA-afgifte in EV’s vast te leggen na transfectie van EV-miRNA’s. De aanpak maakt gelijktijdige analyse van meerdere EV-miRNA’s en cel-miRNA’s mogelijk, afhankelijk van de mogelijkheden van de cytometer. Bovendien, hoewel flowcytometrie-analyse waardevolle inzichten kan opleveren in de biologie van EV-miRNA, is het niet zonder beperkingen. Hoewel sommige van de beperkingen kunnen worden overwonnen wanneer ze worden gebruikt in combinatie met andere tec…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen de steun en het advies van Dr. Jill Hutchcroft, directeur van de Flow Cytometry Core Facility aan de Purdue University. Dit werk werd ondersteund door R01CA226259 en R01CA205420 aan A.L.K., een American Lung Association Innovation Award (ANALA2023) IA-1059916 aan A.L.K., een Purdue Shared resource facility grant P30CA023168, en een vlaggenschip Fulbright Doctoral Scholarship toegekend door het Department of the State, VS aan HH.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
Referencias
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
