使用流式细胞术追踪miRNA释放到细胞外囊泡中
Summary
在这里，我们描述了一种简单的方案，该方案能够对荧光标记的microRNA的丰度进行 体外 评估，以研究microRNA包装的动力学并输出到细胞外囊泡（EVs）。
Abstract
细胞外囊泡 （EV） 是细胞通讯的重要介质，由各种不同的细胞分泌。这些 EV 将生物活性分子（包括蛋白质、脂质和核酸（DNA、mRNA、microRNA 和其他非编码 RNA）从一个细胞运送到另一个细胞，导致受体细胞的表型后果。在所有种类繁多的 EV 货物中，microRNA （miRNA） 因其在塑造微环境和教育受体细胞方面的作用而受到广泛关注，因为它们在 EV 中具有明显的失调和丰度。其他数据表明，许多 miRNA 被主动加载到 EV 中。尽管有这些明确的证据，但对输出动力学和miRNA分选机制的研究是有限的。在这里，我们提供了一个使用EV-miRNA流式细胞术分析的方案，可用于了解EV-miRNA加载的动力学并识别参与miRNA输出的机制。在该方案中，预先确定在EV中富集并从供体细胞中耗尽的miRNA与荧光团偶联并转染到供体细胞中。然后使用 qRT-PCR 验证荧光标记的 miRNA 是否加载到 EV 中并从细胞中去除。作为转染对照和门控转染细胞群的工具，包括荧光标记的细胞RNA（细胞保留和EV耗尽）。在72小时内评估用EV-miRNA和细胞保留miRNA转染的细胞的荧光信号。与细胞保留的 miRNA 相比，EV-miRNA 特异性的荧光信号强度迅速降低。使用这种简单的方案，现在可以评估miRNA加载的动力学，并确定负责将miRNA加载到EV中的各种因素。
Introduction
MicroRNA （miRNA） 是小非编码 RNA 中表征最强的亚群之一，以其在转录后基因调控中的关键作用而闻名。大多数 miRNA 的表达和生物发生遵循一系列协调的事件，这些事件始于细胞核中主要 miRNA （pri-miRNA） 的转录。在微处理器复合物将核加工成前体 miRNA （pre-miRNA） 后，pre-miRNA 被输出到细胞质中，在那里它们被 RNase III 核酸内切酶进一步加工，切成 21-23 个核苷酸成熟的 miRNA 双链体1。加工后的成熟 miRNA 的一条链与靶信使 RNA （mRNA） 结合，导致靶标降解或翻译抑制2。基于miRNA在同时调控多种不同靶标mRNA中的多效性作用，miRNA表达受到严格调控也就不足为奇了3。事实上，不恰当的表达会导致各种疾病状态，尤其是在癌症中。miRNA 的异常表达不仅代表了疾病特异性特征，而且还已成为预后和治疗潜力的靶标 4,5,6。除了细胞内作用外，miRNA还具有非自主作用。例如，miRNA 可以被供体细胞选择性地包装成 EV 并输出到受体位点，在那里它们在正常和疾病生理学中引发不同的表型反应 7,8,9。
尽管有明确证据表明 EV 相关 miRNA 是功能性生物分子，但尚不完全了解 miRNA 的特定亚群在癌症等疾病状态下如何失调，以及细胞机器如何选择 miRNA 并将其分类到 Evs10,11 中。鉴于 EV-miRNA 在调节微环境方面的潜在作用，确定参与选择 miRNA 输出的机制以充分阐明 EV 在细胞间通讯和疾病发病机制中的作用至关重要。了解miRNA释放到EV中的过程不仅可以突出miRNA输出的重要介质，还可以为潜在的治疗方法提供见解。为了达到这种知识水平，需要调整工具以忠实地解决这些新的实验问题。事实上，由于新技术和控制措施的引入，评估电动汽车的研究呈指数级增长12,13。在评估输出到EV中的miRNA的丰度方面，下一代测序和定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）一直是当前的标准工具。虽然这些工具可用于评估 EV 中 miRNA 的丰度，但它们的灵敏度和特异性存在局限性，并且使用这些静态方法来评估动力学是不够的。描述miRNA输出到EV的动态需要结合使用专门的工具。在这里，我们提出了一个使用荧光偶联miRNA的综合方案，以分析miRNA从供体细胞释放和掺入EV的动力学。我们还讨论了该方法的优点和局限性，并提供了最佳使用建议。本文介绍的通用方法对于有兴趣研究 miRNA 释放到 EV 中的研究人员及其在细胞通讯和疾病中的潜在作用很有用。
Protocol
Representative Results
Discussion
新建立的方案能够在转染 EV-miRNA 后捕获 miRNA 释放到 EV 中的动力学。该方法允许同时分析多个 EV-miRNA 和细胞 miRNA，具体取决于细胞仪的功能。此外，虽然流式细胞术分析可以为EV miRNA生物学提供有价值的见解，但它并非没有局限性。尽管与其他技术结合使用时可以克服一些限制，以获得更全面的理解。
EV 生物学的一个新兴兴趣领域是理解 miRNA 选择性输出到 EV中…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢普渡大学流式细胞术核心设施主任Jill Hutchcroft博士的支持和建议。这项工作得到了 A.L.K. 的 R01CA226259 和 R01CA205420、美国肺脏协会创新奖 （ANALA2023） IA-1059916 给 A.L.K.、普渡大学共享资源设施赠款P30CA023168以及美国国务院授予 HH 的旗舰富布赖特博士奖学金的支持。
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
Referencias
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