Seguimiento de la liberación de miARN en vesículas extracelulares mediante citometría de flujo
Summary
Aquí, describimos un protocolo sencillo que permite la evaluación in vitro de la abundancia de microARN marcados con fluorescencia para estudiar la dinámica del empaquetamiento y exportación de microARN a vesículas extracelulares (EV).
Abstract
Las vesículas extracelulares (VE) son mediadores importantes de la comunicación celular que son secretadas por una variedad de células diferentes. Estos VE transportan moléculas bioactivas, incluidas proteínas, lípidos y ácidos nucleicos (ADN, ARNm, microARN y otros ARN no codificantes), de una célula a otra, lo que tiene consecuencias fenotípicas en las células receptoras. De todas las diversas cargas de VE, los microARN (miARN) han atraído una gran atención por su papel en la configuración del microambiente y en la educación de las células receptoras debido a su clara desregulación y abundancia en los VE. Los datos adicionales indican que muchos miARN se cargan activamente en los VE. A pesar de esta clara evidencia, la investigación sobre la dinámica de la exportación y los mecanismos de clasificación de miARN es limitada. Aquí, proporcionamos un protocolo que utiliza el análisis de citometría de flujo de EV-miRNA que se puede utilizar para comprender la dinámica de la carga de EV-miRNA e identificar la maquinaria involucrada en la exportación de miRNA. En este protocolo, los miARN predeterminados para enriquecerse en VE y agotarse de las células del donante se conjugan con un fluoróforo y se transfectan en las células del donante. A continuación, se verifica la carga de los miARN marcados con fluorescencia en los VE y el agotamiento de las células mediante qRT-PCR. Como control de transfección y como herramienta para controlar la población transfectada de células, se incluye un ARN celular marcado con fluorescencia (retenido por células y agotado por EV). Las células transfectadas tanto con el miARN EV como con el miARN retenido por células se evalúan en busca de señales fluorescentes en el transcurso de 72 h. La intensidad de la señal de fluorescencia específica para los miARN EV disminuye rápidamente en comparación con el miARN retenido en la célula. Utilizando este sencillo protocolo, ahora se podría evaluar la dinámica de la carga de miARN e identificar varios factores responsables de la carga de miARN en los VE.
Introduction
Los microARN (miARN) son uno de los subconjuntos mejor caracterizados de pequeños ARN no codificantes, que son conocidos por su papel fundamental en la regulación génica postranscripcional. La expresión y la biogénesis de la mayoría de los miRNAs siguen una serie coordinada de eventos que comienza con la transcripción de los miRNAs primarios (pri-miRNAs) en el núcleo. Después del procesamiento nuclear por el complejo del microprocesador en miARN precursores (pre-miARN), los pre-miARN se exportan al citoplasma, donde se someten a un procesamiento adicional por la endonucleasa ARNasa III, en dúplex de miARN maduros de 21-23 nucleótidos1. Una de las hebras del miARN maduro procesado se une a los ARN mensajeros (ARNm) diana, lo que conduce a la degradación o represión traduccional de las dianas2. Sobre la base del papel pleiotrópico de los miARN en la regulación simultánea de múltiples ARNm diana diversos, no es sorprendente que la expresión de miARN esté estrictamente regulada3. De hecho, la expresión inapropiada contribuye a varios estados de enfermedad, especialmente en el cáncer. La expresión aberrante de miRNAs no solo representa una firma específica de la enfermedad, sino que también ha surgido como una diana para el potencial pronóstico y terapéutico 4,5,6. Además de sus funciones intracelulares, los miARN también tienen funciones no autónomas. Por ejemplo, las células donantes pueden empaquetar selectivamente los miARN en VE y exportarlos a los sitios receptores, donde provocan diversas respuestas fenotípicas en la fisiología normal y de la enfermedad 7,8,9.
A pesar de la clara evidencia de que los miRNAs asociados a EV son biomoléculas funcionales, no se comprende completamente cómo subconjuntos específicos de miRNAs están desregulados en estados patológicos como el cáncer y cómo la maquinaria celular selecciona y clasifica los miRNAs enEvs 10,11. Dado el papel potencial de los miARN EV en la modulación del microambiente, es fundamental identificar los mecanismos implicados en la exportación de miARN seleccionados para dilucidar completamente el papel de los VE en la comunicación intercelular y la patogénesis de la enfermedad. Comprender el proceso de liberación de miARN en los VE no solo destacará los mediadores importantes de la exportación de miARN, sino que también puede proporcionar información sobre posibles terapias. Para alcanzar este nivel de conocimiento, es necesario adaptar las herramientas para abordar fielmente estas nuevas preguntas experimentales. De hecho, los estudios que evalúan los VE están creciendo exponencialmente debido a la introducción de nuevas técnicas y controles12,13. En relación con la evaluación de la abundancia de miRNAs exportados a VE, la secuenciación de nueva generación y la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR) han sido las herramientas estándar actuales. Si bien estas herramientas son útiles para evaluar la abundancia de miARN en los VE, existen limitaciones en cuanto a su sensibilidad y especificidad, y el uso de estos enfoques estáticos para evaluar la dinámica es insuficiente. Delinear la dinámica de la exportación de miARN a los VE requiere una combinación de herramientas especializadas. Aquí, presentamos un protocolo completo que utiliza miARN conjugados con fluorescencia, para analizar la dinámica de la liberación de miARN de las células donantes y la incorporación a los VE. También discutimos las ventajas y limitaciones del método y brindamos recomendaciones para un uso óptimo. El método versátil presentado en este artículo será útil para los investigadores interesados en estudiar la liberación de miARN en los VE y sus posibles funciones en la comunicación celular y la enfermedad.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo recientemente establecido permite capturar la cinética de liberación de miARN en los VE después de la transfección de los MIARN de EV. El enfoque permite el análisis simultáneo de múltiples EV-miRNAs y miRNAs celulares, sujeto a las capacidades del citómetro. Además, aunque el análisis de citometría de flujo puede proporcionar información valiosa sobre la biología de los miARN de los VE, no está exento de limitaciones. Sin embargo, algunas de las limitaciones pueden superarse cuando se utilizan…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el apoyo y los consejos de la Dra. Jill Hutchcroft, Directora del Centro Central de Citometría de Flujo de la Universidad de Purdue. Este trabajo fue apoyado por R01CA226259 y R01CA205420 a A.L.K., un Premio a la Innovación de la Asociación Americana del Pulmón (ANALA2023) IA-1059916 a A.L.K., una P30CA023168 de subvención del centro de recursos compartidos de Purdue y una beca de doctorado Fulbright otorgada por el Departamento de Estado, EE. UU. a H.H.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
Referencias
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