Suivi de la libération de miARN dans les vésicules extracellulaires à l’aide de la cytométrie en flux
Summary
Nous décrivons ici un protocole simple qui permet d’évaluer in vitro l’abondance des microARN marqués par fluorescence afin d’étudier la dynamique de l’emballage et de l’exportation des microARN dans les vésicules extracellulaires (VE).
Abstract
Les vésicules extracellulaires (VE) sont d’importants médiateurs de la communication cellulaire qui sont sécrétés par une variété de cellules différentes. Ces VE transportent des molécules bioactives, notamment des protéines, des lipides et des acides nucléiques (ADN, ARNm, microARN et autres ARN non codants), d’une cellule à l’autre, entraînant des conséquences phénotypiques dans les cellules réceptrices. De toutes les cargaisons de véhicules électriques, les microARN (miARN) ont attiré beaucoup d’attention pour leur rôle dans la formation du microenvironnement et dans l’éducation des cellules réceptrices en raison de leur dérégulation évidente et de leur abondance dans les véhicules électriques. Des données supplémentaires indiquent que de nombreux miARN sont activement chargés dans les VE. Malgré ces preuves évidentes, les recherches sur la dynamique de l’exportation et les mécanismes de tri des miARN sont limitées. Ici, nous fournissons un protocole utilisant l’analyse par cytométrie en flux de l’EV-miARN qui peut être utilisé pour comprendre la dynamique de la charge EV-miARN et identifier la machinerie impliquée dans l’exportation des miARN. Dans ce protocole, les miARN prédéterminés à être enrichis en VE et appauvris à partir des cellules du donneur sont conjugués à un fluorophore et transfectés dans les cellules du donneur. Les miARN marqués par fluorescence sont ensuite vérifiés pour leur chargement dans les VE et leur épuisement des cellules à l’aide de la qRT-PCR. En tant qu’outil de contrôle de la transfection et d’identification de la population de cellules transfectées, un ARN cellulaire marqué par fluorescence (conservé par cellule et appauvri en EV) est inclus. Les cellules transfectées à la fois avec le miARN EV et le miARN retenu par la cellule sont évaluées pour les signaux fluorescents sur une période de 72 h. L’intensité du signal de fluorescence spécifique des miARN EV diminue rapidement par rapport aux miARN retenus par les cellules. À l’aide de ce protocole simple, il est maintenant possible d’évaluer la dynamique de la charge des miARN et d’identifier divers facteurs responsables de la charge des miARN dans les VE.
Introduction
Les microARN (miARN) sont l’un des sous-ensembles de petits ARN non codants les mieux caractérisés, connus pour leur rôle essentiel dans la régulation des gènes post-transcriptionnels. L’expression et la biogenèse de la plupart des miARN suivent une série coordonnée d’événements qui commence par la transcription des miARN primaires (pri-miARN) dans le noyau. Après le traitement nucléaire par le complexe de microprocesseurs en précurseurs-miARN (pré-miARN), les pré-miARN sont exportés vers le cytoplasme, où ils subissent un traitement ultérieur par l’endonucléase RNase III, en 21-23 duplex de miARN matures nucléotidiques1. L’un des brins du miARN mature traité se lie aux ARN messagers cibles (ARNm), conduisant à la dégradation ou à la répression traductionnelle des cibles2. Sur la base du rôle pléiotrope des miARN dans la régulation simultanée de plusieurs ARNm cibles diverses, il n’est pas surprenant que l’expression des miARN soit étroitement régulée3. En effet, une expression inappropriée contribue à divers états pathologiques, en particulier dans le cancer. L’expression aberrante des miARN représente non seulement une signature spécifique à la maladie, mais est également apparue comme une cible pour le potentiel pronostique et thérapeutique 4,5,6. En plus de leurs rôles intracellulaires, les miARN ont également des rôles non autonomes. Par exemple, les miARN peuvent être emballés sélectivement dans des VE par des cellules donneuses et exportés vers des sites receveurs où ils suscitent diverses réponses phénotypiques dans la physiologie normale et pathologique 7,8,9.
Malgré des preuves évidentes que les miARN associés aux VE sont des biomolécules fonctionnelles, on ne comprend pas complètement comment des sous-ensembles spécifiques de miARN sont dérégulés dans des états pathologiques tels que le cancer et comment la machinerie cellulaire sélectionne et trie les miARN en Evs10,11. Compte tenu du rôle potentiel des microARN EV dans la modulation du microenvironnement, il est essentiel d’identifier les mécanismes impliqués dans l’exportation de certains miARN afin d’élucider pleinement le rôle des VE dans la communication intercellulaire et la pathogenèse de la maladie. Comprendre le processus de libération des miARN dans les VE permettra non seulement de mettre en évidence les médiateurs importants de l’exportation des miARN, mais aussi de fournir des informations sur les thérapies potentielles. Pour atteindre ce niveau de connaissance, il est nécessaire d’adapter les outils pour répondre fidèlement à ces nouvelles questions expérimentales. En effet, les études qui évaluent les VE connaissent une croissance exponentielle en raison de l’introduction de nouvelles techniques et de nouveaux contrôles12,13. En ce qui concerne l’évaluation de l’abondance des miARN exportés dans les VE, le séquençage de nouvelle génération et la réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse quantitative (qRT-PCR) sont les outils standard actuels. Bien que ces outils soient utiles pour évaluer l’abondance des miARN dans les VE, leur sensibilité et leur spécificité sont limitées, et l’utilisation de ces approches statiques pour évaluer la dynamique est insuffisante. La délimitation de la dynamique de l’exportation des miARN dans les VE nécessite une combinaison d’outils spécialisés. Nous présentons ici un protocole complet utilisant des miARN conjugués par fluorescence, afin d’analyser la dynamique de la libération des miARN à partir des cellules donneuses et de leur incorporation dans les VE. Nous discutons également des avantages et des limites de la méthode et fournissons des recommandations pour une utilisation optimale. La méthode polyvalente présentée dans cet article sera utile aux chercheurs intéressés par l’étude de la libération de miARN dans les VE et de leurs rôles potentiels dans la communication cellulaire et les maladies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole nouvellement établi permet de capturer la cinétique de la libération des miARN dans les VE après la transfection des miARN EV. L’approche permet l’analyse simultanée de plusieurs miARN EV et miARN cellulaires, sous réserve des capacités du cytomètre. De plus, bien que l’analyse par cytométrie en flux puisse fournir des informations précieuses sur la biologie des miARN EV, elle n’est pas sans limites. Bien que certaines des limitations puissent être surmontées lorsqu’elles sont utilisée…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Jill Hutchcroft, directrice de l’installation centrale de cytométrie en flux de l’Université Purdue, pour son soutien et ses conseils. Ce travail a été soutenu par R01CA226259 et R01CA205420 à A.L.K., un prix de l’innovation de l’American Lung Association (ANALA2023) IA-1059916 à A.L.K., une subvention de la facilité de ressources partagées de Purdue P30CA023168 et une bourse doctorale Fulbright accordée par le Département d’État, États-Unis à H.H.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
Referencias
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
