유세포 분석을 사용하여 세포외 소포체로의 miRNA 방출 추적
Summary
여기서는 형광 표지된 microRNA의 풍부함에 대한 체외 평가를 통해 microRNA 패키징의 역학을 연구하고 세포외 소포체(EV)로 내보낼 수 있는 간단한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
세포외 소포체(EV)는 다양한 세포에서 분비되는 세포 통신의 중요한 매개체입니다. 이러한 EV는 단백질, 지질 및 핵산(DNA, mRNA, microRNA 및 기타 비암호화 RNA)을 포함한 생체 활성 분자를 한 세포에서 다른 세포로 셔틀하여 수용 세포에서 표현형 결과를 초래합니다. 다양한 EV 화물 중에서 microRNA(miRNA)는 EV의 명확한 조절 장애와 풍부함으로 인해 미세 환경을 형성하고 수용 세포를 교육하는 역할로 많은 주목을 받았습니다. 추가 데이터는 많은 miRNA가 EV에 활발하게 로드된다는 것을 나타냅니다. 이러한 명백한 증거에도 불구하고, miRNA 분류의 역학 및 메커니즘에 대한 연구는 제한적입니다. 여기서는 EV-miRNA 로딩의 역학을 이해하고 miRNA 내보내기와 관련된 메커니즘을 식별하는 데 사용할 수 있는 EV-miRNA의 유세포 분석을 사용하는 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에서는 EV에서 농축되고 공여체 세포에서 고갈되도록 미리 결정된 miRNA를 형광단에 접합하고 공여체 세포로 transfection합니다. 그런 다음 형광 태그가 부착된 miRNA는 qRT-PCR을 사용하여 EV에 로딩되고 세포에서 고갈되는지 확인합니다. transfection control 및 transfection된 세포 집단을 게이팅하기 위한 도구로서, 형광 표지된 세포 RNA(세포 보유 및 EV 고갈)가 포함되어 있습니다. EV-miRNA 및 cell-retained-miRNA로 transfection된 세포는 72시간 동안 형광 신호에 대해 평가됩니다. EV-miRNA에 특이적인 형광 신호 강도는 세포 보유 miRNA에 비해 빠르게 감소합니다. 이 간단한 프로토콜을 사용하여 이제 miRNA 로딩의 역학을 평가하고 miRNA를 EV에 로딩하는 다양한 요인을 식별할 수 있습니다.
Introduction
MicroRNA(miRNA)는 전사 후 유전자 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 작은 비암호화 RNA의 가장 특징적인 하위 집합 중 하나입니다. 대부분의 miRNA의 발현과 생물발생은 핵에서 일차 miRNA(pri-miRNA)의 전사로 시작되는 일련의 조정된 사건을 따릅니다. 마이크로프로세서 복합체에 의해 precursor-miRNA(pre-miRNA)로 핵 처리된 후, pre-miRNA는 세포질로 내보내지고, 여기서 RNase III 엔도뉴클레아제에 의해 추가 처리를 거쳐 21-23개의 뉴클레오티드 성숙 miRNA 듀플렉스로 다이서됩니다1. 처리된 성숙한 miRNA의 가닥 중 하나가 표적 메신저 RNA(mRNA)에 결합하여 표적의 분해 또는 번역 억제를 유도합니다2. 여러 다양한 표적 mRNA를 동시에 조절하는 miRNA의 다원성 역할에 기초하여 miRNA 발현이 엄격하게 조절되는 것은 놀라운 일이 아닙니다3. 실제로, 부적절한 표현은 다양한 질병 상태, 특히 암의 원인이 됩니다. miRNA의 비정상적인 발현은 질병 특이적 시그니처를 나타낼 뿐만 아니라 예후 및 치료 잠재력의 표적으로 부상했습니다 4,5,6. 세포 내 역할 외에도 miRNA는 비자율적 역할도 합니다. 예를 들어, miRNA는 기증자 세포에 의해 선택적으로 EV로 패키징되어 정상 및 질병 생리학에서 다양한 표현형 반응을 유도하는 수용 부위로 내보낼 수 있습니다 7,8,9.
EV 관련 miRNA가 기능적 생체 분자라는 명확한 증거에도 불구하고, miRNA의 특정 하위 집합이 암과 같은 질병 상태에서 어떻게 조절되지 않는지, 그리고 세포 기계가 miRNA를 Evs10,11로 선택하고 분류하는 방법은 완전히 이해되지 않았습니다. 미세환경 조절에서 EV-miRNA의 잠재적인 역할을 감안할 때, 세포 간 통신 및 질병 발병기전에서 EV의 역할을 완전히 설명하기 위해 일부 miRNA의 내보내기와 관련된 메커니즘을 식별하는 것이 중요합니다. miRNA가 EV로 방출되는 과정을 이해하면 miRNA 수출의 중요한 매개체를 강조할 뿐만 아니라 잠재적인 치료제에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이러한 수준의 지식을 얻기 위해서는 이러한 새로운 실험적 질문에 충실하게 대처할 수 있도록 도구를 조정해야 합니다. 실제로, 전기차를 평가하는 연구는 새로운 기술과 제어 장치의 도입으로 인해 기하급수적으로 증가하고 있다12,13. EV로 수출된 miRNA의 풍부도를 평가하는 것과 관련하여 차세대 염기서열분석 및 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)이 현재 표준 도구였습니다. 이러한 도구는 EV에서 miRNA의 풍부도를 평가하는 데 유용하지만 감도와 특이성에는 한계가 있으며 역학을 평가하기 위해 이러한 정적 접근 방식을 사용하는 것은 충분하지 않습니다. miRNA를 EV로 수출하는 역학을 설명하려면 특수 도구의 조합이 필요합니다. 여기에서는 형광 복합 miRNA를 사용하여 기증자 세포에서 miRNA 방출 및 EV로의 통합의 역학을 분석하는 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 또한 이 방법의 장점과 한계에 대해 논의하고 최적의 사용을 위한 권장 사항을 제공합니다. 이 논문에 제시된 다재다능한 방법은 EV로의 miRNA 방출과 세포 통신 및 질병에서의 잠재적 역할을 연구하는 데 관심이 있는 연구자에게 유용할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
새로 확립된 프로토콜은 EV-miRNA의 transfection 후 EV로 miRNA 방출의 역학을 캡처할 수 있습니다. 이 접근법을 사용하면 세포분석기의 기능에 따라 여러 EV-miRNA 및 cell-miRNA를 동시에 분석할 수 있습니다. 또한 유세포 분석 분석은 EV miRNA 생물학에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있지만 한계가 없는 것은 아닙니다. 그러나 보다 포괄적인 이해를 위해 다른 기술과 함께 사용할 때 일부 제한 사항을 극복할…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Purdue University의 유세포 분석 핵심 시설 책임자인 Jill Hutchcroft 박사의 지원과 조언에 감사드립니다. 이 연구는 R01CA226259 및 A.L.K.의 R01CA205420, A.L.K.에 대한 미국 폐 협회 혁신상(ANALA2023) IA-1059916, 퍼듀 공유 자원 시설 보조금 P30CA023168, 미국 국무부가 H.H.에 수여하는 플래그십 풀브라이트 박사 장학금의 지원을 받았습니다.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
Referencias
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
