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Biology

Un método paso a paso para la reconstitución de un transportador ABC en partículas lipídicas Nanodisc

Published: August 31, 2012 doi: 10.3791/3910
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of British Columbia

Summary

Nanodiscos son pequeñas partículas discoidales que incorporan proteínas de membrana en un pequeño parche de doble capa de fosfolípidos. Proporcionamos un protocolo visual que muestra la incorporación paso a paso del transportador de MalFGK2 en un disco.

Abstract

El nanodisc es una partícula discoidal (~ 10-12 nm grande) que las proteínas de membrana trampa en un pequeño parche de doble capa de fosfolípidos. El nanodisc es una opción particularmente atractiva para el estudio de proteínas de membrana, especialmente en el contexto de las interacciones ligando-receptor. El método por primera vez por Sligar y colegas se basa en las propiedades anfipáticas de una ingeniería altamente a-helicoidal andamio de proteínas derivadas de la apolipoproteína A1. Las caras hidrófobas de la proteína andamio interactúan con los de acilo graso cadenas laterales de la bicapa de lípido, mientras que las regiones polares frente al entorno acuoso. Los análisis de proteínas de membrana en nanodiscos tienen ventajas significativas sobre liposoma porque las partículas son pequeñas, homogéneas y solubles en agua. Además, los métodos bioquímicos y biofísicos normalmente reservados para las proteínas solubles se pueden aplicar, y desde ambos lados de la membrana. En este protocolo visual, se presenta una reconstitución paso a paso de un carácter bienracterizado ABC transportador bacteriano, el macho-2 MalFGK complejo. La formación del disco es un proceso de auto-ensamblaje que depende de las interacciones hidrofóbicas que tienen lugar durante la eliminación progresiva del detergente. Se describen los pasos esenciales y se destaca la importancia de elegir una correcta proteína-lípido con el fin de limitar la formación de agregados y partículas más grandes de liposomas como polidispersos. Calidad simples controles, tal como cromatografía de filtración en gel, electroforesis en gel nativo y la espectroscopia de dispersión de luz dinámica asegurar que los discos han sido correctamente reconstituido.

Protocol

Proceso de reconstitución global

El proceso de reconstitución se inicia mediante la mezcla de la proteína de membrana andamio (MSP) con el complejo purificado MalFGK 2 en presencia de solubilizadas en detergente fosfolípidos. El paso es seguido por la eliminación lenta del detergente por un material de poliestireno adsorbente llamado Bio-Beads o Amberlite (Figura 1). El proceso de auto-ensamblaje ocurre muy probablemente debido a las interacciones apolares entre los fosfolípidos hidrófobos, el complejo MalFGK 2 y la superficie de la proteína anfipática MSP. El producto final es una partícula discoide formado por dos moléculas de envolver alrededor de la MSP 2 MalFGK complejo. Las partículas se separan de los aductos y los agregados por ultra-centrifugación y cromatografía analítica de exclusión por tamaño. Las partículas se caracterizan por electroforesis en gel nativo y espectroscopia de dispersión de luz dinámica.

título "> 1. preparación de la membrana andamio de proteínas, MSP

  1. El Su-etiquetados MSP (versión MSP1D1 1) se produce a partir pMSP1D1 plásmido en E. coli BL21 (DE3) indujo a una DO de 600 ~ 0,5 con 0,5 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido durante 3 horas a 37 ° C.
  2. Las células se recogieron por centrifugación a 5.000 xg durante 10 min a 4 ° C y se resuspendieron en tampón que contenía TSG10 100 mM fluoruro de fenilmetanosulfonilo.
  3. Las células se lisaron con una prensa francesa (3x) a 8.000 psi y el material insoluble se eliminó por centrifugación a 5.000 xg durante 10 min a 4 ° C. La fracción soluble que contiene el MSP se aísla por ultra-centrifugación a 125.000 xg durante 45 min.
  4. El MSP se purifica mediante cromatografía de níquel quelante de uso de ~ 1,5 ml Ni Sepharose HP en TSG10 buffer. Los contaminantes se eliminan por lavado con TSG10 tampón que contiene 50 mM de imidazol. El MSP se eluye con tampón que contiene TSG10 600 mMimidazol. La proteína purificada se dializó en tampón TSG10 y almacenado en -70 º C a una concentración de proteína de ~ 10-15 mg / ml.

2. Preparación de la MalFGK 2 Complejo

  1. El MalFGK 2 compleja, su etiquetado en el extremo C-terminal de Malk, se expresa a partir del plásmido pBAD22-FGK en E. coli BL21 (DE3) y se indujo a una DO de 600 ~ 0,5 con 0,2% de L-arabinosa durante 3 horas a 37 ° C.
  2. Después de la lisis celular y centrifugación como en el paso 1,3, el sedimento de membrana se resuspende en tampón TSG20 a una concentración final de 5 mg / ml. El material se solubiliza con w / v 1% de n-dodecil-β-maltopiranósido (DDM) durante 3 horas a 4 ° C con agitación suave.
  3. El material insoluble se elimina por ultra-centrifugación como en el paso 1,3 y el sobrenadante que contiene el solubilizado 2 MalFGK complejo se recogió y se purificó como en el paso 1,4, pero sin diálisis.
  4. Further purificación se realizó mediante cromatografía de filtración en gel en tampón TSGD en un Superdex 200 HR 10/300 columna a un caudal de 0,5 ml / min.

3. Preparación de fosfolípidos

  1. Una E. lípidos totales coli extracto disuelto en cloroformo se separó en alícuotas de 1.000 nmol en tubos de microcentrífuga tornillos de cabeza. El disolvente se evaporó bajo una corriente suave de nitrógeno y se secó adicionalmente durante una noche en un desecador a vacío.
  2. La película de lípido se disuelve en tampón TS a una concentración de 5 nM final y vortex vigorosamente, y se sonicó. Los lípidos disueltos aparecerá ligeramente opaco debido a su insolubilidad en general en tampón TS acuoso, pero debe permanecer en suspensión. DDM se añade a una concentración final de 0,5% (~ 10 mM), en la que la solución se vuelva clara.
  3. La mezcla de lípidos se coloca en un baño de agua y el pulso se sonicó durante 5 veces para ~ 5 seg. La mezcla de lípidos se almacenan a 4 ° C durante un máximo de 1 week.

4. Preparación de Bio-Beads

  1. Aproximadamente el 10-15 ml (volumen seco) Bio-Beads se coloca en un tubo de 50 ml.
  2. Las perlas se lavaron sucesivamente con 50 ml de metanol al 100%, 95% de etanol, milliQ H 2 O, y finalmente tampón TS (dos veces cada uno).
  3. Las perlas lavadas se almacenan a 4 ° C en tampón de ~ 10 ml de TS.

5. Nanodisc Reconstitución

  1. El MSP se diluye en tampón TSGD a la concentración final de ~ 7 mg / ml (~ 0,3 mM).
  2. ~ 2 nmol de 2 purificado MalFGK complejo se mezclan a una proteína: MSP: lípido de 1:3:60 o 1:3:400 en tampón TSGD. La concentración final es de 6 micras MalFGK 2, 18 mM y lípidos MSP 360 micras (1:3:60) o 2,4 mM (lípidos 1:3:400). El volumen final es de 300 l. La concentración final de DDM es 0,08% (~ 1,6 mM). La concentración final de glicerol depende de la cantidad de lípido añadido, pero sigue siendo alrededor de 5-10% v / v ~ 50 l de Bio-Bead suspensión se añadió al tubo y se incuba la mezcla durante toda la noche en un agitador a 4 º C.
  3. Las perlas se sedimentan por gravedad y la solución se pipeteó a través de una punta estrecha para evitar en la medida Bio-Beads como sea posible.
  4. Grandes precipitados se separan por ultra-centrifugación a 100.000 xg durante 20 min. Los discos se purificó por cromatografía de filtración en gel como en el paso 2,4 en TSG10 tampón. Las fracciones que contenían los discos se reúnen y una alícuota se vuelve a inyectar en la columna de filtración en gel mismo para probar la estabilidad de la preparación.
  5. Los discos purificadas pueden almacenarse a -70 ° C durante un período prolongado de tiempo. Después de la descongelación en hielo, los discos debe ser sometido a ultra-centrifugación como en el paso 5,5 para eliminar el potencial de precipitados. Una alícuota se analizó por cromatografía de filtración en gel para garantizar que la agregación o precipitación significativa no se produjo durante la descongelaciónproceso.

6. Electroforesis en gel nativo

  1. 1 M de nanodiscos (~ 0,2 mg / ml) se analizan por PAGE nativa 6, 7 (Tris-HCl pH 8,8, 4-12%) para evaluar la calidad de la reconstitución (Figura 3A).
  2. La unión de macho (1 M) a la 2-complejo MalFGK reconstituyó en nanodiscos también es evaluado por nativo-PAGE (Figura 3A).
  3. Después de la electroforesis, el gel se tiñe con azul de Coomassie durante 10 min, y se decoloró durante ~ 1 hr.

7. Dispersión de luz dinámica (DLS)

  1. Nanodiscos se purificó por cromatografía de filtración en gel como en el paso 2,4 en TSG10 tampón utilizando un Superdex 200 HR 10/300 columna a un caudal de 0,1 ml / min. Las fracciones que contenían nanodiscos se reúnen y se concentran a ~ 10 mg / ml con un filtro Amicon centrífuga.
  2. La muestra se filtra dos veces (0,22 micras filtro) antes del análisis por DLS utilizandoun instrumento DynaPro NANOSTAR (Wyatt Technology) en un volumen de 1 l cubeta de cuarzo interno. Los datos se ajustaron usando el software de dinámica (Wyatt Technology) para estimar el diámetro y el peso molecular de las partículas.

8. ATPasa Medidas

  1. La actividad de ATPasa de MalFGK 2-reconstituidas nanodiscos se determina mediante un ensayo colorimétrico 8.
  2. 1 M de discos purificadas y 1 mM de ATP se mezclan con cantidades crecientes de MalE y se incubaron a 37 ° C durante 20 min. La liberación de fosfato inorgánico se midió a 660 nm.
  3. La cantidad de fosfato liberado se comparó con una curva estándar generada con una solución estándar de fósforo.

9. Los resultados representativos

Los nanodiscos se purificó por cromatografía de filtración en gel (Figura 2A, izquierda). El cromatograma muestra que la mayoría de la reconstituida dISCS (negro traza) se eluyen como un solo pico, mientras que los discos hechos con exceso de lípidos (curva roja) eluyen en el volumen vacío y como una serie de picos anchos. La calidad de los nanodiscos se analiza adicionalmente por electroforesis en gel nativo y espectroscopia de dispersión de luz dinámica (DLS). Reconstituidos correctamente los discos migran como una banda fuerte en el gel mientras que los reconstituida en presencia de un exceso de lípidos migrar como frotis (Figura 2A, derecha). El análisis por DLS muestra que la población disco es homogéneo con un diámetro medio de 11,4 nm (Figura 2B). Los discos reconstituidas tienen un peso molecular aparente de 215 kDa basado en la aproximación DLS. Las muestras reconstituidas en la presencia de exceso de lípidos de visualización ampliamente distribuido radios alrededor de 100 nm, que es típico de las muestras no homogéneas.

La calidad de la MalFGK 2 complejo se evaluó por electroforesis en gel nativo y su actividad por ATPasalas mediciones (Figura 3). El macho proteína de unión a maltosa se ​​une con una afinidad alta a la MalFGK 2 transportador 9, 10. Utilizando electroforesis no desnaturalizante en gel, es posible detectar un complejo entre el macho y MalFGK 2 (Figura 3A). La estimulación de la actividad de la ATPasa MÄLK 2 por MalE se muestra en la Figura 3B.

Figura 1
Figura 1. Diagrama de flujo típico para el protocolo de reconstitución.

Figura 2
Figura 2. Control de calidad de la preparación nanodisc. A. Análisis de filtración en gel (Superdex 200 HR 10 / columna de 300) de los nanodiscos reconstituido en relación baja en lípidos (01/03/60; trazo negro) o la relación de lípido alta (1/3/400; trazo rojo). Electroforesis en gel nativo de la preparación del disco mismo. Molecular marcadores de peso en kDa se indican. B. La luz dinámica de análisis de dispersión de la preparación de un mismo disco. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 3
Figura 3. Análisis de la MalFGK 2-nanodisc partículas. A. Análisis Gel cambio de MalE incubaron con cantidades crecientes de MalFGK 2 nanodisc partículas. B. actividad ATPasa de la MalFGK 2-nanodisc partículas como una función de la concentración masculina.

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Discussion

Se describe un procedimiento sencillo para la reconstitución del transportador de maltosa en nanodiscos. El transportador es ATPasa activa y la interacción con el macho pareja de unión soluble puede ser recreada (Figura 3). La reconstitución exitosa del transportador en nanodiscos abrir el camino para un análisis adicional biofísica y bioquímica. De particular interés será el análisis sistemático de la ATPasa y la actividad Malk maltosa transporte en el detergente, liposomas y nanodiscos. Transportadores ABC cambiar conformaciones durante el ciclo de transporte, pero la contribución de los lípidos a estos cambios conformacionales quedan por explorar.

La realización de la nanodisc es relativamente simple, pero pequeñas desviaciones de las condiciones óptimas puede conducir de manera irreversible la agregación de proteínas. En este informe, hacemos hincapié en la importancia de escoger una proteína correcta: proporción de lípidos, ya que un exceso de lípidos dará lugar a la production de grandes polidispersos liposoma-como partículas que no responden a la calificación biofísico de una nanodisc. Un análisis previo empleada MSP muy alta relación lípidos para la reconstitución del transportador de maltosa (1/120 en comparación con 1/20 en nuestro análisis), pero las partículas formadas no se caracterizaron adicionalmente 11. En cualquier caso, es crucial para analizar cuidadosamente la calidad del material reconstituido utilizando otras técnicas de filtración en gel, tales como espectroscopia de dispersión de la luz, ultracentrifugación analítica o más simplemente, electroforesis en gel nativo. La importancia de este control de calidad se puso de relieve durante la reconstitución de la bacteriorrodopsina y P-glicoproteína 12. Otros dos parámetros puede afectar enormemente al éxito de la reconstitución: 1) la pureza de la proteína de la membrana objetivo y la ausencia de agregados y 2) la proporción correcta entre la proteína de membrana y proteínas de andamiaje. Además, el tipo de fosfolípido i incorporadonto del disco, así como la longitud de la proteína de membrana andamio, pueden contribuir a la eficacia de la reconstitución. Otros parámetros tales como la solubilidad y la estabilidad de la proteína de membrana en solución de detergente, el sistema de tampón, la temperatura y el tiempo de duración de la reconstitución también puede ser necesario ajustar la hora de optimizar el protocolo de reconstitución. Por ejemplo, proteínas de la membrana de andamios de diferentes longitudes producir nanodiscos de diferentes tamaños 1, que pueden ayudar a la reconstitución de grandes complejos de proteínas de membrana u oligómeros de proteínas de membrana.

El nanodisc se ha combinado con éxito con los métodos biofísicos como SPR, el CCI, y la espectroscopia de fluorescencia 12-16 para ayudar a la investigación membrana que está luchando con la metodología cuantitativa. Recientemente, el nanodisc ha sido combinada con espectrometría de masas cuantitativa para ayudar a la identificación de proteínas de membrana interactomes con mejor cobertura y la precisión17. La industria farmacéutica se ha visto limitado por las mismas dificultades que plagan el mundo académico en el estudio de proteínas de membrana, aunque es un hecho que los fármacos más prescritos objetivo proteínas de membrana (receptores, canales, transportadores, sensores). Se puede predecir que el nanodisc ayudará al desarrollo de las estrategias de detección de drogas que trabajan con proteínas de membrana integradas.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud. CSC fue financiado por una beca postdoctoral de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá. FD es un Tier II Cátedra de Investigación de Canadá.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter Millipore UFC805008 Follow manufacturer's protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent Bio-Rad 152-3920
E. coli total lipids Avanti Polar Lipids 100500C Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin GE Healthcare 17-5268-01
Phosphorous standard solution Sigma-Aldrich P3869
pMSP1D1 Addgene 20061
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare 17-5172-01
Table I. Specific reagents.
Name Composition Comments
DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C
MalFGK2 stock 1-2 mg/ml
50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol
0.03% w/v DDM		 Store at -70 °C after purification
MSP stock 10-15 mg/ml
50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol		 Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles
Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids
0.5% w/v (10 mM) DDM
50 mM Tris-HCl, pH 7.9
50 mM NaCl		 Store at 4 °C for 1 week
TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9
50 mM NaCl		 Store at 4 °C
TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol		 Store at 4 °C
TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8
100 mM NaCl
20% v/v glycerol		 Store at 4 °C
TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9
100 mM NaCl
10% v/v glycerol
0.03% w/v DDM		 Store at 4 °C and add DDM just before use

Table II. Solution recipes.

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References

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