التفريق بين الأطفال حديثي الولادة ماوس خلايا الجلد الجذعية المشتقة في مثل جرثومة خلايا<em> في المختبر</em
Summary
في السنوات الأخيرة وقد تجلى تشكيل الخلايا الجرثومية باستخدام أساليب الثقافة في المختبر باستخدام عدة أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية الجسدية. هذه المادة سوف يقدم بصريا التفريق بين الأطفال حديثي الولادة الماوس الخلايا الجذعية المشتقة إلى أوائل الخلايا الشبيهة البويضة.
Abstract
دراسة تشكيل خلية جرثومية والتمايز تقليديا صعبة للغاية نظرا لانخفاض أعداد الخلايا ومواقعها عميقة داخل الأجنة النامية. توفر "مغلقة" في النظام القائم على المختبر يمكن أن لا تقدر بثمن لفهمنا لعملية تكوين الأمشاج. وقد تجلى تشكيل البويضة تشبه الخلايا (OLCs) من الخلايا الجذعية الجسدية، معزولة عن الجلد الماوس حديثي الولادة، ويمكن تصور في هذا البروتوكول الفيديو. وOLCs الناتجة عن مختلف علامات متسقة مع البويضات مثل Oct4، فاسا، Bmp15، وScp3. ومع ذلك، فإنها لا تزال غير قادر على الخضوع لنضوج أو الإخصاب بسبب الفشل في إتمام الانقسام الاختزالي. سوف يشكل هذا البروتوكول توفير نظام يمكن أن يكون مفيدا لدراسة تشكيل مرحلة مبكرة وتمايز الخلايا الجرثومية إلى أكثر الأمشاج نضجا. أثناء تمايز في وقت مبكر من عدد من الخلايا معربا عن Oct4 (الخلايا الجرثومية مثل المحتملة) تصل ~ 5٪، ولكن في الوقت الراهن جمعةormation الوقود النووي من OLCs لا يزال غير فعال نسبيا. البروتوكول هو نسبيا على التوالي إلى الأمام على الرغم من رعاية خاصة ينبغي اتخاذها لضمان السكان خلية البداية هو صحي وعلى ممر في وقت مبكر.
Introduction
خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر، وتحدث عملية تكوين الأمشاج من خلال سلسلة من المراحل بما في ذلك الخلايا الجرثومية البدائية (المؤتمر الشعبي) تشكيل، والهجرة، وأخيرا الاستعمار من التلال الغدد التناسلية. خلال هذا الوقت الخضوع بغتش الانتشار والتمايز في الأمشاج بصورة متزايدة أكثر نضجا 1. حقيقة أن بغتش ترحيل من قاعدة السقاء في المعى المؤخر الجنين وأخيرا على طول الجدار الظهري استعمار في نهاية المطاف التلال الغدد التناسلية يجعل من الصعب للغاية لدراسة 2. على الرغم من التقدم في هذا المجال، وقد أعاق دراسات تحاول فهم تشكيل المؤتمر الشعبي والتمايز بواسطة عددهم محدود، والموقع، وطبيعة المهاجرة 3،4.
في السنوات الأخيرة وقد ثبت الخلايا الجذعية الجنينية لديها القدرة على تشكيل الخلايا الجرثومية في المختبر 5،6. وبالمثل، كما تم عرض العديد من الخلايا الجذعية الجسدية لديها القدرة على تشكيل الخلايا الجرثومية الفلبسبب زراعة في المختبر 7-11. تنبع مؤخرا الخلايا المعزولة من الجلد الماوس الجدد كانت متباينة في المختبر إلى خلايا تشبه الجرثومية والبويضات مرحلة مبكرة 12. أثناء تمايز مجموعة فرعية من الخلايا الجذعية معربا عن Oct4 زيادة وشكلت هياكل تشبه المجمعات قزع-البويضة. البويضة تشبه الخلايا (OLCs) يمكن التقاطها من الثقافات ومقارنة البويضات الطبيعية. باستخدام هذه الثقافة OLCs طريقة قياس 40-45 ميكرون ويتم الحصول على التي تعبر عن علامات مشابهة لالبويضات مثل Gdf9b، فاسا، وDAZL. حتى الآن على OLCs الناتجة تظل غير قادر حتى تنضج أو يتم إخصابها 12.
على الرغم من أن OLCs تزال عاجزة عن العمل البروتوكول المستخدم لتشكيل هذه OLCs قد لا تزال لديها فائدة باعتبارها مقايسة لدراسة تشكيل وتطوير في وقت سابق من الخلايا الجرثومية مرحلة ضمن مغلقة في نظام المختبر. المنشور الأصلي مناقشة تشكيل OLCs من ذلكالخلايا الجذعية ماتيك استخدام الجلد الخنزيري الجنين كمصدر الخلايا الجذعية 8. التوسع في هذه الدراسة عرضت الخلايا PGC مثل شكلت في وقت مبكر خلال التمايز الناجم عن أن تكون السلائف إلى OLCs وصريحة مثل علامات PGC كما OCT4، فاسا، ستيلا، C-KIT، وDAZL 13. تدعم هذه البيانات إمكانية الاستفادة من هذا النظام لدراسة تشكيل خلية جرثومية والتمايز في المختبر. سيظهر بروتوكول يستخدم لتشكيل OLCs من الجلد الماوس حديثي الولادة في هذه المقالة الفيديو. هذا البروتوكول يوفر في نموذج المختبر لدراسة تطور الخلايا الجرثومية التي يمكن أن توفر وسيلة لتوضيح العوامل الهامة لانتشارها وتمايز.
Protocol
Representative Results
Discussion
حتى الآن OLCs وظيفية لم يتم تطويرها باستخدام تماما في المختبر فحص. مؤخرا دراسة من قبل هاياشي وآخرون. كان قادرا على إنتاج نسل من PGC تشبه الخلايا شكلت في المختبر ونقل في الجسم الحي لمزيد من التطوير 14. بدءا من خلايا ES أو الخلايا المحفزة التي يسببها ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم الأشخاص ذوي الإعاقة من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة الزمالة (CIHR) ومنحة CIHR لجيرالد M. كيدر في جامعة وسترن. ويود الكاتب أيضا أن نعترف Julang لى فى جامعة جويلف للمساعدة في تطوير بروتوكول المعروضة هنا.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
- van den Hurk, R., Zhao, J. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).
- Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration. Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).
- Lawson, K. A., Hage, W. J. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).
- Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation. Development. 110, 521-528 (1990).
- Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science. 300, 1251-1256 (2003).
- Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).
- Wang, L., Cao, J., et al. Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells. Cell Biosci. 2, 27 (2012).
- Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin. Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).
- Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line. Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).
- Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells. DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).
- Song, S. H., Kumar, B. M., et al. Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells. Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).
- Dyce, P. W., Liu, J., et al. In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin. PLoS One. 6, e20339 (2011).
- Linher, K., Dyce, P., Li, J. Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells. PLoS One. 4, e8263 (2009).
- Hayashi, K., Ogushi, S., et al. Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice. Science. , (2012).
