세균과 같은 세포로 신생아 마우스 피부 유래 줄기 세포의 분화<em> 체외</em

Summary

최근 몇 년 동안 체외 배양 방법에서 사용하는 생식 세포의 형성은 체세포 줄기 세포의 여러 가지 유형을 사용하여 증명되었습니다. 이 문서에서는 시각적으로 초기 난 모세포 – 유사 세포로 신생아 마우스 유래 줄기 세포의 분화를 발표 할 예정이다.

Abstract

생식 세포의 형성과 분화를 연구하는 것은 전통적으로 낮은 세포 수 및 개발 배아에서 깊은 자신의 위치로 인해 매우 어려운 일이다. 체외 기반 시스템에서 "폐쇄"의 여부는 배우자 형성에 대한 우리의 이해를 위해 매우 유용 할 수 있습니다. 신생아 마우스 피부에서 고립 된 체세포 줄기 세포에서 난자 세포와 같은 (OLCs)의 형성이 입증되었으며,이 비디오 프로토콜 시각화 할 수 있습니다. 결과 OLCs는 OCT4, 바사, Bmp15 및 Scp3으로 난자와 일치 다양한 마커를 표현한다. 그러나, 그들은 성숙 또는 감수 분열을 완료하는 데 오류로 인해 수정을받을 수없는 남아 있습니다. 이 프로토콜은 더 성숙한 배우자로 생식 세포의 초기 형성과 분화를 연구하는 데 유용 시스템을 제공합니다. 초기 분화 OCT4을 표현하는 세포의 수 (잠재적 인 생식 세포와 같은)하지만 현재 F를 ~ 5 %에​​ 도달OLCs의 ormation은 상대적으로 비효율적 남아있다. 특별한주의가 시작 세포 인구가 건강하고 초기 통로이다 않도록주의해야하지만 프로토콜은 비교적 똑바로 앞으로이다.

Introduction

초기 배아 발생 동안, 배우자 형성은 원시 생식 세포 (PGC) 형성, 마이그레이션 및 생식 능선의 마지막으로 식민지 등 일련의 단계를 통해 발생합니다. 이 시간 동안 PGCs는 점점 더 성숙 배우자 ^1에 증식과 분화를 겪는다. PGCs는 배아 hindgut에 allantois의 기지에서 마침내 결국 생식 능선을 식민지화 등의 벽을 따라 마이그레이션하는 것이 사실은 ² 공부하기가 대단히 어렵다. 분야의 발전에도 불구하고, PGC 형성과 분화를 이해하려는 연구들은 제한된 수의 위치 및 철새 성격 ^3,4에 의해 방해되었다.

최근 배아 줄기 세포는 체외 ^5,6에서 생식 세포를 형성 할 수있는 잠재력을 가지고 보여왔다. 마찬가지로, 여러 체세포 줄기 세포는 배아 세포가 FOLL 형성 할 수있는 잠재력을 가지고 표시되었습니다체외 배양 ^7-11 때문에. 최근 신생아 쥐의 피부에서 분리 된 줄기 세포 배아 같은 세포와 초기 단계의 난자를 ^12으로 체외에서 분화되었다. 분화 OCT4을 표현하는 줄기 세포의 집합이 증가하고 구조를 닮은 적운-난자 복합체가 형성되었다. 난 모세포와 같은 세포 (OLCs) 문화에서 고른 자연 난자에 비교할 수 있습니다. 40-45 μm의 측정이 문화 방법 OLCs를 사용하면 얻을 수있다 그러한 Gdf9b, VASA 및 DAZL으로 난자에 명시 유사한 표식입니다. 최신 결과 OLCs ^{12 성숙하거나} 기름지게 할 수없는 남아 있습니다.

OLCs이 OLCs을 형성하는 데 사용되는 프로토콜은 여전히 내 초기 단계의 생식 세포의 형성과 발전을 연구하는 분석으로 유틸리티가 작동하지 않을 수없는 남아 있지만, 체외 시스템에 마감했다. 그래서에서 OLCs의 형성을 논의 출판물매틱 줄기 세포는 줄기 세포 소스 ^8로 태아의 돼지 피부를 활용. 유도 분화 초기에 형성된 PGC와 같은 세포, OCT4로 OLCs을 표현 같은 PGC 마커에 VASA, STELLA, C-KIT, 그리고 DAZL ¹³ 전구체로 표시되었던 연구를 확대. 이 데이터는 체외에서 생식 세포의 형성과 분화를 연구하기 위해이 시스템을 활용하는 가능성을 지원합니다. 신생아 쥐의 피부에서 OLCs를 형성하기 위해 이용되는 프로토콜이 비디오 문서에서 설명 될 것입니다. 이 프로토콜은 자신의 증식과 분화 요인이 중요한 명료하게하는 수단을 제공 할 수 생식 세포 발달을 연구하는 체외 모델을 제공합니다.

Protocol

1. 미디어 준비 실험이 진행되는 세포 배양 인큐베이터에서 느슨해 캡 사용 및 장소를 사전에 용지 2 ~ 3 시간을 준비합니다. 본 프로토콜에서 사용 미디어 : 1 개 B27, 40 NG / ML bFGF를, 20 NG / ML EGF와 보충 DMEM/F12로 구성된 세포 매체를 줄기 준비한다. 0.05 IU의 FSH, 0.03 IU LH, 3 MG / ML BSA, 5 μL / ㎖ ITS, 0.23 mM의 나트륨 피루 베이트, 1 MG / ML Fetuin, 1 NG / ML EGF와 보충 M199로 구성된 생식 세포 …

Representative Results

처음에는 세포가 배양 접시 바닥에 부착 확산. 차별화에 42-72 시간에 작은 정지 OCT4 양성 세포가 형성하고 (그림 1A) 확산. 곧 이러한 세포의 시각화 후 대부분 사라지고 첨부 된 세포 배양 하단에 밀도 식민지 집계를 형성합니다. 몇 일 다음이 집계 문화 표면에서 분리합니다. 이러한 골재의 일부 대형 세포 (그림 1B 및 1C) 관찰 할 수있다. 초기 구상에 따라 세포…

Discussion

기능 OLCs 날짜를하려면 생체 분석에 완벽을 사용하여 개발되지 않았습니다. 최근 하야시 외 의해 연구. 체외에서 형성되고 발전 ¹⁴ 생체 내에서 전송되는 세포 PGC 같은에서 자손을 생산할 수 있었다. 그들은 생체 이식 후 회복, 세포처럼 PGC를 형성 할 수 있었다 ES 세포 나 유도 만능 세포로 시작은 성숙 시비, 자손 ^14를 생성하는 데 사용 될 수 있었?…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	12500
B27	Invitrogen	17504044
EGF	Invitrogen	PHG0311
bFGF	Invitrogen	PHG0266
ITS	Invitrogen	41400-045
BSA	Sigma	A-6003
Sodium Pyruvate	Invitrogen	11360-070
Fetuin	Sigma	F3385
FSH	Sioux Biochemicals	915
LH	Sioux Biochemicals	925
M199	Invitrogen	31100-035
24 well plates	Nunc	144530
10 cm dishes	VWR	25384-088
15 ml tubes	BD	352095