Дифференциация новорожденных кожи мышей стволовые клетки в зародышевые-подобных клеток<em> В пробирке</em
Summary
В последние годы образовании половых клеток с использованием методов культурах клеток было продемонстрировано с использованием нескольких различных типов клеток соматических стволовых клеток. В этой статье мы представим дифференциации новорожденных мышей стволовые клетки для ранней ооцитов-подобных клеток.
Abstract
Изучение ЗАРОДЫШЕОБРАЗОВАНИЕ и дифференцировки клеток традиционно было очень трудно из-за низкого количества клеток и их расположение глубоко внутри развивающихся эмбрионов. Наличие «закрытых» в пробирке система может оказаться бесценным для нашего понимания гаметогенеза. Формирование яйцеклетки-подобных клеток (ЭПУ) из соматических стволовых клеток, выделенных из кожи новорожденных мышей, была продемонстрирована и могут быть визуализированы в этом видео протокола. Полученные ЭПУ выражать различные маркеры соответствуют ооцитов, таких как Oct4, Vasa, Bmp15 и SCP3. Тем не менее, они по-прежнему не в состоянии пройти созревания или оплодотворения из-за неспособности завершить мейоза. Этот протокол будет создать систему, которая будет полезна для изучения ранней стадии формирования и дифференциации зародышевых клеток в более зрелых гамет. Во время ранней дифференциации количество клеток, экспрессирующих Oct4 (потенциальный зародыш-подобные клетки) достигает ~ 5%, однако в настоящее время FРеформации из ЭПУ остается относительно неэффективны. Протокол относительно прямой, хотя особое внимание следует уделять обеспечению исходной клеточной популяции здоровых и на ранней проход.
Introduction
Во время раннего эмбриогенеза, гаметогенеза происходит через ряд этапов, включая изначальную зародышевых клеток (PGC) образование, миграция, и, наконец, колонизации половых хребтов. За это время PGCs пройти пролиферации и дифференцировке во все более и более зрелые гаметы 1. Тот факт, что PGCs мигрировать из базы аллантоис в эмбрион кишке и, наконец, вдоль дорсальной стенки в конечном счете колонизации половых гребни делает их чрезвычайно трудным для изучения 2. Несмотря на успехи в области исследования пытаются понять PGC формирования и дифференциации препятствовали их ограниченное количество, расположение и миграционного характера 3,4.
В последние годы эмбриональные стволовые клетки, как было показано, имеют потенциал для формирования половых клеток в пробирке 5,6. Кроме того, несколько стволовых соматические клетки, также было показано, что потенциал для формирования половых клеток Follблагодаря в пробирке культивирования 7-11. Последнее стволовые клетки, выделенные из кожи новорожденных мышей были дифференцированы в пробирке в зародышевые-подобные клетки и ооциты ранней стадии 12. Во время дифференцировки подмножество стволовых клеток, экспрессирующих Oct4 увеличена и структуры, напоминающие кумулюсных-ооцита комплексы были сформированы. Ооцитов-подобных клеток (ЭПУ) могут быть выбраны из культур и по сравнению с природным ооцитов. С помощью этого метода культуры ЭПУ измерения 40-45 мкм получаются, которое выражает подобные маркеры, такие как ооциты Gdf9b, Vasa, и DAZL. На сегодняшний день в результате ЭПУ-прежнему не созреть или быть оплодотворены 12.
Хотя ПУЭ остаются не в состоянии функционировать протокол, используемый для формирования этих ЭПУ могут по-прежнему находят применение в качестве анализа для изучения формирования и развития половых клеток ранних стадия в рамках закрытой системы в пробирке. Оригинальная публикация обсуждают формирование ЭПУ из такхор стволовых клеток использовали плода свиной кожи в качестве источника стволовых клеток 8. Развивая это исследование PGC-подобные клетки формируются в раннем возрасте во время индуцирует дифференциацию было показано, что предшественники ПУЭ и ускоренная такие маркеры как PGC OCT4, Vasa, Стелла, C-KIT и DAZL 13. Эти данные подтверждают потенциал использовании этой системы для изучения образование зародышей и дифференцировки клеток в пробирке. Протокол, используемый для формирования ЭПУ из кожи новорожденных мышей будет показано в этом видео статье. Этот протокол предлагает в пробирке модель для изучения развития зародышевых клеток, которые могут обеспечить средства для выяснения факторов, важных для их пролиферации и дифференцировки.
Protocol
Representative Results
Discussion
На сегодняшний день функциональные ЭПУ не были разработаны с использованием полностью в пробирке анализа. В последнее время исследования Хаяши и соавт. Был в состоянии произвести потомство от PGC-подобные клетки формируются в пробирке и в естественных условиях пере?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PWD при поддержке Канадского института исследований в области здравоохранения общение (CIHR) и CIHR грант Джеральд М. Киддер в Западном университете. Автор хотел бы также признать Julang Ли в университете гвельфов за помощь в разработке протокола, представленные здесь.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
- van den Hurk, R., Zhao, J. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).
- Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration. Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).
- Lawson, K. A., Hage, W. J. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).
- Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation. Development. 110, 521-528 (1990).
- Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science. 300, 1251-1256 (2003).
- Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).
- Wang, L., Cao, J., et al. Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells. Cell Biosci. 2, 27 (2012).
- Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin. Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).
- Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line. Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).
- Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells. DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).
- Song, S. H., Kumar, B. M., et al. Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells. Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).
- Dyce, P. W., Liu, J., et al. In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin. PLoS One. 6, e20339 (2011).
- Linher, K., Dyce, P., Li, J. Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells. PLoS One. 4, e8263 (2009).
- Hayashi, K., Ogushi, S., et al. Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice. Science. , (2012).
