В последние годы образовании половых клеток с использованием методов культурах клеток было продемонстрировано с использованием нескольких различных типов клеток соматических стволовых клеток. В этой статье мы представим дифференциации новорожденных мышей стволовые клетки для ранней ооцитов-подобных клеток.
Изучение ЗАРОДЫШЕОБРАЗОВАНИЕ и дифференцировки клеток традиционно было очень трудно из-за низкого количества клеток и их расположение глубоко внутри развивающихся эмбрионов. Наличие «закрытых» в пробирке система может оказаться бесценным для нашего понимания гаметогенеза. Формирование яйцеклетки-подобных клеток (ЭПУ) из соматических стволовых клеток, выделенных из кожи новорожденных мышей, была продемонстрирована и могут быть визуализированы в этом видео протокола. Полученные ЭПУ выражать различные маркеры соответствуют ооцитов, таких как Oct4, Vasa, Bmp15 и SCP3. Тем не менее, они по-прежнему не в состоянии пройти созревания или оплодотворения из-за неспособности завершить мейоза. Этот протокол будет создать систему, которая будет полезна для изучения ранней стадии формирования и дифференциации зародышевых клеток в более зрелых гамет. Во время ранней дифференциации количество клеток, экспрессирующих Oct4 (потенциальный зародыш-подобные клетки) достигает ~ 5%, однако в настоящее время FРеформации из ЭПУ остается относительно неэффективны. Протокол относительно прямой, хотя особое внимание следует уделять обеспечению исходной клеточной популяции здоровых и на ранней проход.
Во время раннего эмбриогенеза, гаметогенеза происходит через ряд этапов, включая изначальную зародышевых клеток (PGC) образование, миграция, и, наконец, колонизации половых хребтов. За это время PGCs пройти пролиферации и дифференцировке во все более и более зрелые гаметы 1. Тот факт, что PGCs мигрировать из базы аллантоис в эмбрион кишке и, наконец, вдоль дорсальной стенки в конечном счете колонизации половых гребни делает их чрезвычайно трудным для изучения 2. Несмотря на успехи в области исследования пытаются понять PGC формирования и дифференциации препятствовали их ограниченное количество, расположение и миграционного характера 3,4.
В последние годы эмбриональные стволовые клетки, как было показано, имеют потенциал для формирования половых клеток в пробирке 5,6. Кроме того, несколько стволовых соматические клетки, также было показано, что потенциал для формирования половых клеток Follблагодаря в пробирке культивирования 7-11. Последнее стволовые клетки, выделенные из кожи новорожденных мышей были дифференцированы в пробирке в зародышевые-подобные клетки и ооциты ранней стадии 12. Во время дифференцировки подмножество стволовых клеток, экспрессирующих Oct4 увеличена и структуры, напоминающие кумулюсных-ооцита комплексы были сформированы. Ооцитов-подобных клеток (ЭПУ) могут быть выбраны из культур и по сравнению с природным ооцитов. С помощью этого метода культуры ЭПУ измерения 40-45 мкм получаются, которое выражает подобные маркеры, такие как ооциты Gdf9b, Vasa, и DAZL. На сегодняшний день в результате ЭПУ-прежнему не созреть или быть оплодотворены 12.
Хотя ПУЭ остаются не в состоянии функционировать протокол, используемый для формирования этих ЭПУ могут по-прежнему находят применение в качестве анализа для изучения формирования и развития половых клеток ранних стадия в рамках закрытой системы в пробирке. Оригинальная публикация обсуждают формирование ЭПУ из такхор стволовых клеток использовали плода свиной кожи в качестве источника стволовых клеток 8. Развивая это исследование PGC-подобные клетки формируются в раннем возрасте во время индуцирует дифференциацию было показано, что предшественники ПУЭ и ускоренная такие маркеры как PGC OCT4, Vasa, Стелла, C-KIT и DAZL 13. Эти данные подтверждают потенциал использовании этой системы для изучения образование зародышей и дифференцировки клеток в пробирке. Протокол, используемый для формирования ЭПУ из кожи новорожденных мышей будет показано в этом видео статье. Этот протокол предлагает в пробирке модель для изучения развития зародышевых клеток, которые могут обеспечить средства для выяснения факторов, важных для их пролиферации и дифференцировки.
На сегодняшний день функциональные ЭПУ не были разработаны с использованием полностью в пробирке анализа. В последнее время исследования Хаяши и соавт. Был в состоянии произвести потомство от PGC-подобные клетки формируются в пробирке и в естественных условиях пере?…
The authors have nothing to disclose.
PWD при поддержке Канадского института исследований в области здравоохранения общение (CIHR) и CIHR грант Джеральд М. Киддер в Западном университете. Автор хотел бы также признать Julang Ли в университете гвельфов за помощь в разработке протокола, представленные здесь.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
BSA | Sigma | A-6003 | |
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
Fetuin | Sigma | F3385 | |
FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
24 well plates | Nunc | 144530 | |
10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
15 ml tubes | BD | 352095 |