Différenciation de la peau de souris nouveau-nés des cellules souches dérivées dans les cellules germinales comme In vitro

Summary

Au cours des dernières années, la formation de cellules germinales en utilisant des méthodes de culture in vitro a été démontrée en utilisant différents types de cellules souches somatiques. Cet article va présenter visuellement la différenciation des cellules souches dérivées de souris nouveau-nés aux cellules ovocyte comme au début.

Abstract

Étude de la formation des cellules germinales et la différenciation a toujours été très difficile en raison du faible nombre de cellules et de leur localisation profonde dans les embryons en développement. La disponibilité d'un «fermé» dans le système de base vitro pourrait s'avérer précieuse pour notre compréhension de la gamétogenèse. La formation d'ovocytes-comme les cellules (LCO) à partir de cellules souches somatiques, isolés à partir de peau de souris nouveau-né, a été démontrée et peut être visualisé dans ce protocole vidéo. Les LCE résultant expriment différents marqueurs compatibles avec les ovocytes comme Oct4, Vasa, BMP15, et SCP3. Toutefois, ils demeurent incapables de se soumettre à la maturation ou la fertilisation en raison d'un défaut de terminer la méiose. Ce protocole fournira un système qui est utile pour l'étude de la formation à un stade précoce et la différenciation des cellules germinales en gamètes matures. Au cours de la différenciation précoce du nombre de cellules exprimant Oct4 (cellules germinales potentielles comme) atteint environ 5%, mais a le formation de LCO reste relativement inefficace. Le protocole est relativement simple si des précautions particulières doivent être prises pour assurer la population de la cellule de départ est en bonne santé et à un passage précoce.

Introduction

Au cours de l'embryogenèse précoce, gamétogénèse se produit à travers une série d'étapes, y compris cellule primordiale de germe (PGC) formation, la migration, et enfin la colonisation des crêtes génitales. Pendant ce temps PGC subissent la prolifération et la différenciation en gamètes de plus en plus matures ^1. Le fait que les PGC migrent à partir de la base de l'allantoïde dans l'intestin postérieur de l'embryon et, enfin, le long de la paroi dorsale finalement coloniser les crêtes génitales qui les rend extrêmement difficiles à étudier ^2. Malgré les progrès réalisés dans le domaine, les études qui tentent de comprendre la....

Protocol

1. Médias Préparation

1. Préparer les médias 2-3 heures à l'avance de l'usage et du lieu avec un bouchon dévissé dans l'incubateur de culture cellulaire où l'expérience aura lieu. Médias utilisés dans le présent protocole:
   1. Préparer un milieu de cellules souches constitué de DMEM/F12 supplémenté avec 1 x B27, 40 ng / ml de bFGF, et 20 ng / ml d'EGF.
   2. Préparer milieu de différenciation des cellules germinales composé de M199 additionné de 0,05 UI de FSH, 0,03 UI LH, 3 mg / ml de BSA, 5 pl / ml ITS, 0,23 mM de pyruvate de sodium, 1 mg / ml Fetuin et 1 ng / ml d'EGF. Un support de base constitué de tous les additifs, mais....

Results

Initialement, les cellules se fixent au fond de la boîte de culture et étalées. À 42-72 h dans la différenciation des cellules en suspension OCT4 positifs petit formulaire et prolifèrent (Figure 1A). Peu de temps après la visualisation de ces cellules la majorité disparaît et les cellules attachées va former des agrégats de colonies denses au fond de la culture. Après quelques jours, ces agrégats se détacher de la surface de culture. Dans certains de ces agrégats une grande cellule peut être observé

Discussion

À ce jour LCE fonctionnelles n'ont pas été développé en utilisant un tout essai in vitro. Récemment, une étude réalisée par Hayashi et al. Était capable de produire une descendance de PGC-comme les cellules formées in vitro et in vivo transféré pour le développement ^14. A partir de cellules souches embryonnaires ou des cellules pluripotentes induites, ils ont pu former PGC comme des cellules qui, une fois récupérée à la suite transplantation in vivo ont pu être.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	12500
B27	Invitrogen	17504044
EGF	Invitrogen	PHG0311
bFGF	Invitrogen	PHG0266
ITS	Invitrogen	41400-045
BSA	Sigma	A-6003
Pyruvate de sodium	Invitrogen	11360-070
Fetuin	Sigma	F3385
FSH	Sioux Biochemicals	915
LH	Sioux Biochemicals	925
M199	Invitrogen	31100-035
24 plaques de puits	Nunc	144530
Boîtes de 10 cm	VWR	25384-088
15 ml tubes	BD	352095