Differenziazione del neonato mouse pelle cellule staminali derivate in cellule germinali-simili<em> In vitro</em
Summary
Negli ultimi anni la formazione di cellule germinali utilizzando metodi in coltura in vitro è stata dimostrata utilizzando diversi tipi di cellule staminali somatiche. Questo articolo presenta visivamente la differenziazione delle cellule staminali derivate topo neonato per primi cellule ovocita-like.
Abstract
Studiare la formazione delle cellule germinali e la differenziazione è sempre stato molto difficile a causa di un basso numero di cellule e la loro posizione nel profondo di sviluppo degli embrioni. La disponibilità di un "chiuso" nel sistema basato vitro potrebbe rivelarsi prezioso per la nostra comprensione della gametogenesi. La formazione di ovociti-come le cellule (oLc) da cellule staminali somatiche, isolate dalla pelle neonato topo, è stata dimostrata e può essere visualizzato in questo protocollo video. Le oLc risultanti esprimono vari marker coerenti con gli ovociti come Oct4, Vasa, BMP15 e SCP3. Tuttavia, rimangono in grado di sottoporsi a maturazione o la fecondazione a causa di un mancato completamento della meiosi. Questo protocollo fornirà un sistema che è utile per studiare la formazione fase iniziale e la differenziazione delle cellule germinali in gameti più mature. Durante precoce differenziazione del numero di cellule che esprimono Oct4 (potenziali cellule germinali-simili) raggiunge ~ 5%, tuttavia attualmente il formazione delle oLc rimane relativamente inefficiente. Il protocollo è relativamente semplice ma particolare cura deve essere presa per assicurare la popolazione di cellule di partenza è sano e ad un passaggio precoce.
Introduction
Durante l'embriogenesi precoce, gametogenesi avviene attraverso una serie di tappe tra cui cellule germinali primordiali (PGC) formazione, migrazione, e, infine, la colonizzazione delle creste delle gonadi. Durante questo periodo PGC subiscono proliferazione e differenziazione in sempre gameti più mature 1. Il fatto che il PGC migrano dalla base del allantoide nella hindgut embrione e infine lungo la parete dorsale finalmente colonizzando le creste delle gonadi li rende estremamente difficile da studiare 2. Nonostante i progressi nel campo, gli studi che tentano di comprendere la formazione PGC e differenziazione sono stati ostacolati dal loro numero limitato, la posizione e la natura migratoria 3,4.
Negli ultimi anni le cellule staminali embrionali hanno dimostrato di avere il potenziale per formare le cellule germinali in vitro 5,6. Analogamente numerosi cellule staminali somatiche hanno anche dimostrato di avere il potenziale di formare cellule germinali Follgrazie de coltura in vitro 7-11. Recentemente staminali cellule isolate dalla cute neonato topo sono state differenziate in vitro in cellule germinali-simili e primi ovociti stage 12. Durante la differenziazione del sottoinsieme delle cellule staminali che esprimono Oct4 aumentata e le strutture che assomigliano complessi cumulo-ovocita si sono formati. L'ovocita-come le cellule (oLc) possono essere ritirati dalle culture e confrontati con ovociti naturali. Utilizzando questo metodo di coltura oLc di misura 40-45 micron si ottengono che esprimono i marcatori simili a ovociti come Gdf9b, VASA, e DAZL. Ad oggi le oLc risultanti rimangono incapaci di maturare o essere fecondati 12.
Sebbene i oLc rimangono incapaci di funzionare il protocollo utilizzato per formare questi oLc può ancora avere utilità come un saggio per studiare la formazione e lo sviluppo delle cellule germinali fase precedente all'interno di un sistema chiuso in vitro. La pubblicazione originale discutere la formazione di oLc da cosìcellule staminali matic utilizzati pelle porcina fetale come fonte di cellule staminali 8. Ampliando tale studio le cellule PGC-come si formano presto durante la differenziazione indotta hanno dimostrato di essere i precursori per la oLc ed esprimere tali marcatori PGC come OCT4, VASA, STELLA, C-KIT, e DAZL 13. Questi dati supportano la possibilità di utilizzare questo sistema per studiare la formazione di cellule germinali e differenziazione in vitro. Il protocollo utilizzato per formare oLc dalla pelle appena nato del mouse sarà dimostrato in questo articolo il video. Questo protocollo offre un modello in vitro per lo studio dello sviluppo delle cellule germinali che possono fornire un mezzo per delucidare i fattori importanti per la loro proliferazione e differenziazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ad oggi oLc funzionali non sono stati sviluppati utilizzando una completamente in vitro. Recentemente uno studio condotto da Hayashi et al. Era in grado di produrre prole da PGC-come le cellule formati in vitro e trasferimento in vivo per un ulteriore sviluppo 14. Partendo da cellule ES o cellule pluripotenti indotte sono stati in grado di formare PGC come le cellule che, una volta recuperati a seguito di trapianto in vivo sono stati in grado di essere maturato, fe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PWD è supportato da una Canadian Institutes of Health Research fellowship (CIHR) e una borsa di CIHR di Gerald M. Kidder alla Western University. L'autore desidera inoltre ringraziare Julang Li presso l'Università di Guelph per un aiuto con lo sviluppo del protocollo presentato qui.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
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