La diferenciación de ratón recién nacido piel derivados de las células madre en células germinales-como<em> In vitro</em
Summary
En los últimos años la formación de las células germinales que utilizan en los métodos de cultivo in vitro se ha demostrado usando varios tipos diferentes de células madre somáticas. En este artículo se presentará visualmente la diferenciación de las células madre derivadas de ratones recién nacidos a principios de células ovocitos similares.
Abstract
El estudio de la formación de células germinales y diferenciación ha sido tradicionalmente muy difícil debido a los números bajos de células y su ubicación en lo profundo de embriones en desarrollo. La disponibilidad de un "cerrado" en el sistema basado en vitro podría resultar muy valiosa para nuestra comprensión de la gametogénesis. La formación de células similares a los ovocitos (OLC) a partir de células madre somáticas, aislados de la piel del ratón recién nacido, se ha demostrado y se puede visualizar en este protocolo video. Los OLC resultantes expresan diversos marcadores consistentes con ovocitos tales como Oct4, Vasa, Bmp15, y SCP3. Sin embargo, siguen siendo no pueden someterse a la maduración o la fertilización debido a un fallo para completar la meiosis. Este protocolo proporcionará un sistema que es útil para el estudio de la formación de fase temprana y la diferenciación de las células germinales en gametos más maduros. Durante la diferenciación temprana el número de células que expresan Oct4 (potenciales células de gérmenes similares) alcanza ~ 5%, sin embargo actualmente la formación de OLC sigue siendo relativamente ineficiente. El protocolo es relativamente sencillo, aunque se debe tener especial cuidado para asegurar la población de células de partida es saludable y en un paso temprano.
Introduction
Durante la embriogénesis temprana, la gametogénesis se produce a través de una serie de etapas, incluyendo células germinales primordiales (PGC) de formación, la migración, y, finalmente, la colonización de las crestas gonadales. Durante este tiempo las CGP se someten a la proliferación y diferenciación en cada vez más gametos maduros 1. El hecho de que las CGP migran desde la base de la alantoides en el intestino posterior del embrión y, finalmente, a lo largo de la pared dorsal eventualmente colonizar las crestas gonadales los hace extremadamente difícil de estudiar 2. A pesar de los avances en el campo, los estudios que intentan comprender la formación de PGC y la diferenciación han sido impedidos por su limitado número, la ubicación y naturaleza migratoria 3,4.
En los últimos años las células madre embrionarias se han demostrado tener el potencial para formar células germinales in vitro 5,6. Del mismo modo, varias células madre somáticas también se han demostrado tener el potencial para formar células germinales Folldebido en cultivo in vitro 7-11. Recientemente las células madre aisladas de la piel de ratones recién nacidos fueron diferenciadas in vitro en células germinales como y ovocitos en fase inicial 12. Durante la diferenciación del subconjunto de las células madre que expresan Oct4 aumentó y se formaron estructuras similares a los complejos cumulus-ovocito. Las células similares a los ovocitos (OLC) se pueden recoger a partir de las culturas y comparación con los ovocitos naturales. El uso de este método de cultivo OLC miden 40-45 micras se obtienen que expresan marcadores similares a los ovocitos como Gdf9b, VASA y DAZL. Hasta la fecha los OLC resultantes siguen siendo incapaces de madurar o ser fecundado 12.
Aunque los OLC siguen siendo incapaz de funcionar el protocolo utilizado para formar estos OLC aún puede tener utilidad como un ensayo para estudiar la formación y el desarrollo de las células germinales en estadio anteriores dentro de un cerrado sistema in vitro. La publicación original discutir la formación de la OLC de locélulas madre matic utilizan piel porcina fetal como fuente de células madre 8. Ampliando este estudio las células PGC-como formados temprano durante la diferenciación inducida mostraron ser los precursores de la expresos tales marcadores PGC OLC y como OCT4, VASA, STELLA, C-KIT y DAZL 13. Este dato apoya el potencial de la utilización de este sistema para estudiar la formación de células germinales y diferenciación in vitro. El protocolo utilizado para formar OLC de piel de ratón recién nacido se demuestra en este artículo de vídeo. Este protocolo ofrece un modelo in vitro para estudiar el desarrollo de células germinales que puede proporcionar un medio para elucidar los factores importantes para su proliferación y diferenciación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hasta la fecha OLC funcionales no se han desarrollado completamente utilizando un ensayo in vitro. Recientemente, un estudio realizado por Hayashi et al. Fue capaz de producir descendencia de PGC-como las células formadas in vitro e in vivo transferido para el desarrollo adicional 14. A partir de células madre embrionarias o de células pluripotentes inducidas que fueron capaces de formar PGC como las células que, cuando se recuperaron después de trasplante in vivo<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PWD es apoyada por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud de becas (CIHR) y una subvención CIHR a Gerald M. Kidder en la Universidad de Western. El autor también desea agradecer Julang Li de la Universidad de Guelph en busca de ayuda con el desarrollo del protocolo que aquí se presenta.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
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