Différenciation de la peau de souris nouveau-nés des cellules souches dérivées dans les cellules germinales comme<em> In vitro</em
Summary
Au cours des dernières années, la formation de cellules germinales en utilisant des méthodes de culture in vitro a été démontrée en utilisant différents types de cellules souches somatiques. Cet article va présenter visuellement la différenciation des cellules souches dérivées de souris nouveau-nés aux cellules ovocyte comme au début.
Abstract
Étude de la formation des cellules germinales et la différenciation a toujours été très difficile en raison du faible nombre de cellules et de leur localisation profonde dans les embryons en développement. La disponibilité d'un «fermé» dans le système de base vitro pourrait s'avérer précieuse pour notre compréhension de la gamétogenèse. La formation d'ovocytes-comme les cellules (LCO) à partir de cellules souches somatiques, isolés à partir de peau de souris nouveau-né, a été démontrée et peut être visualisé dans ce protocole vidéo. Les LCE résultant expriment différents marqueurs compatibles avec les ovocytes comme Oct4, Vasa, BMP15, et SCP3. Toutefois, ils demeurent incapables de se soumettre à la maturation ou la fertilisation en raison d'un défaut de terminer la méiose. Ce protocole fournira un système qui est utile pour l'étude de la formation à un stade précoce et la différenciation des cellules germinales en gamètes matures. Au cours de la différenciation précoce du nombre de cellules exprimant Oct4 (cellules germinales potentielles comme) atteint environ 5%, mais a le formation de LCO reste relativement inefficace. Le protocole est relativement simple si des précautions particulières doivent être prises pour assurer la population de la cellule de départ est en bonne santé et à un passage précoce.
Introduction
Au cours de l'embryogenèse précoce, gamétogénèse se produit à travers une série d'étapes, y compris cellule primordiale de germe (PGC) formation, la migration, et enfin la colonisation des crêtes génitales. Pendant ce temps PGC subissent la prolifération et la différenciation en gamètes de plus en plus matures 1. Le fait que les PGC migrent à partir de la base de l'allantoïde dans l'intestin postérieur de l'embryon et, enfin, le long de la paroi dorsale finalement coloniser les crêtes génitales qui les rend extrêmement difficiles à étudier 2. Malgré les progrès réalisés dans le domaine, les études qui tentent de comprendre la formation PGC et différenciation ont été entravés par leur nombre limité, l'emplacement et la nature migratoire de 3,4.
Ces dernières années, les cellules souches embryonnaires ont été montré pour avoir le potentiel pour former des cellules germinales in vitro 5,6. De même, plusieurs cellules souches somatiques ont également été montrés pour avoir le potentiel pour former des cellules germinales Follen raison de culture in vitro 7-11. Récemment cellules souches isolées à partir de peau de souris nouveau-né ont été différenciées in vitro en cellules germinales et des ovocytes comme un stade précoce 12. Au cours de la différenciation du sous-ensemble des cellules souches exprimant Oct4 augmentée et des structures ressemblant à des complexes cumulus-ovocytes ont été formés. L'ovocyte-comme les cellules (LCE) peuvent être ramassés par les cultures et comparés aux ovocytes naturelles. En utilisant cette méthode de mesure culture LCO 40-45 um sont obtenus qui expriment des marqueurs similaires à ovocytes comme Gdf9b, VASA, et DAZL. À ce jour, les LCO résultant demeurent incapables de mûrir ou être fécondé 12.
Bien que les LCO restent incapables de fonctionner le protocole utilisé pour former ces LCO peut encore avoir une utilité comme un test pour étudier la formation et le développement des cellules germinales de stade plus précoce dans un système in vitro fermé. La publication originale discuter de la formation de LCO de manièrecellules souches matiques utilisés peau de porc foetal comme source de cellules souches 8. Développant cette étude, les cellules PGC-comme formées très tôt au cours de la différenciation induite ont été montrés à être les précurseurs de la LCE et d'exprimer de tels marqueurs PGC comme OCT4, VASA, STELLA, C-KIT, et DAZL 13. Ces données confirment le potentiel de l'utilisation de ce système pour étudier la formation des cellules germinales et la différenciation in vitro. Le protocole utilisé pour former LCE du nouveau-né peau de la souris sera démontré dans cet article de la vidéo. Ce protocole offre un modèle in vitro pour étudier le développement des cellules germinales qui peuvent fournir un moyen d'élucider les facteurs importants pour leur prolifération et la différenciation in.
Protocol
Representative Results
Discussion
À ce jour LCE fonctionnelles n'ont pas été développé en utilisant un tout essai in vitro. Récemment, une étude réalisée par Hayashi et al. Était capable de produire une descendance de PGC-comme les cellules formées in vitro et in vivo transféré pour le développement 14. A partir de cellules souches embryonnaires ou des cellules pluripotentes induites, ils ont pu former PGC comme des cellules qui, une fois récupérée à la suite transplantation in viv…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PWD est soutenu par une bourse des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) et une subvention des IRSC pour Gerald M. Kidder à l'Université Western. L'auteur tient également à remercier Julang Li de l'Université de Guelph pour aider à l'élaboration du protocole présenté ici.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
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