Submillisecond Conformational Veranderingen in Eiwitten opgelost door Fotothermische straalafbuiging
Summary
Hier een toepassing van de fotothermische straalafbuigingsbuizen techniek in combinatie met een gekooide calciumverbinding, DM-nitrophen tot microseconde en milliseconde dynamiek en energiebalans van structurele veranderingen met betrekking tot calcium vereniging een neuronale calcium sensor downstream Regulatory Element Antagonist Modulator volgen we verslag .
Abstract
Fotothermische straalafbuiging met fotoakoestische calorimetrie en thermische raster behoort tot de familie van fotothermische methoden die de tijd-profiel volume en enthalpie veranderingen van licht geïnduceerde conformationele veranderingen in eiwitten op microseconde tijdschaal die niet toegankelijk zijn milliseconde traditionele stop bewaken flow instrumenten. Bovendien, omdat algemene wijzigingen in volume en / of enthalpie gepeild, deze technieken kunnen worden toegepast om proteïnen en andere biomacromolecules die een fluorofoor en een chromofoor label of ontbreekt. Om dynamiek en energetica van structurele veranderingen in verband met Ca 2 monitoren + binden aan calcium transducers, zoals neuronale calcium sensoren, een gekooide calciumverbinding, DM-nitrophen, wordt gebruikt om foto-trekker een snelle (τ <20 msec) toename van vrije calcium concentratie en het bijbehorende volume en enthalpie veranderingen worden gesondeerd met fotothermische bundeldeflectie techniek.
Introduction
Fotothermische werkwijzen zoals fotoakoestische calorimetrie, fotothermische straalafbuigingsbuizen (VOB), en voorbijgaande rooster gekoppeld nanoseconde laser excitatie vormen een krachtig alternatief voor optische spectroscopie voorbijgaande voor tijdsopgeloste studies kortstondige tussenproducten 1,2. In tegenstelling tot optische technieken, zoals transiënte absorptie-en IR-spectroscopie, die volgen het tijdsprofiel van absorptie veranderingen in de chromofoor omgeving; fotothermische technieken detecteren tijdsafhankelijkheid van warmte / volumeveranderingen en daarom waardevolle gereedschappen voor het onderzoeken tijdprofielen optisch "stille" processen. Tot dusver fotoakoestische calorimetrie en voorbijgaande rooster is met succes toegepast op conformationele dynamica van foto-geactiveerde processen waaronder twee atomen ligand migratie globins 3,4 ligand interacties met zuurstofsensor eiwit bestuderen FixL 5, elektronen en protonen transport in heem-koper oxidasen 6 eennd fotosysteem II evenals foto-isomerisatie in rhodopsin 7 en conformationele dynamica in cryptochrome 8.
Om de toepassing van fotothermische technieken om biologische systemen die ontbreken intern chromofoor en / of fluorofoor te breiden, werd de PBD techniek in combinatie met het gebruik van gekooide verbinding aan foto-trekker verhoging van ligand / substraat concentratie binnen enkele microseconden of sneller, afhankelijk het gekooide compound. Deze aanpak zorgt voor de opvolging van de dynamiek en energetica van structurele veranderingen in verband met de ligand / substraat binden aan eiwitten die ontbreken een interne fluorofoor of chromofoor en op tijd-schaal die niet toegankelijk door commerciële stopstroming instrumenten. Hier een toepassing van PBD de thermodynamica van de kooi verbinding Ca2 + DM-nitrophen, foto-splitsing en de kinetiek voor Ca 2 + associatie met het C-terminale domein van de neuronale calcium sensor omlaag monitorenstroom Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) wordt gepresenteerd. De Ca 2 + is foto-vrijgelaten uit Ca 2 + DM-nitrophen binnen 10 usee en rebinds een unphotolysed kooi met een tijdconstante van ~ 300 msec. Anderzijds, in aanwezigheid van apoDREAM extra kinetische zich op de milliseconde tijdschaal waargenomen en weerspiegelt de ligand binding aan het eiwit. De toepassing van PBD conformationele transities in biologische systemen sonde of andere manier beperkt vanwege de instrumentele moeilijkheden, bijvoorbeeld zware uitlijning van de sonde en pompbundel een sterke en reproduceerbare PBD signaal bereiken. Echter, een zorgvuldige ontwerp van een instrumentatie set-up, een nauwkeurige controle van de temperatuur, en een zorgvuldige afstemming van de sonde en pompbundel een consistente en robuuste PBD signaal dat monitoring van tijdopgeloste volume en enthalpie veranderingen maakt op een breed tijdschaal van 10 usee ongeveer 200 msec. Bovendien modificaties van de experimentele procedure voor de detectie van monster en referentiesporen verzekeren onder identieke temperatuur, buffersamenstelling, optische cel oriëntatie, laservermogen, etc. vermindert de experimentele fout in afgemeten reactievolumes en enthalpie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het fysieke principe fotothermische werkwijzen is dat een foto-geëxciteerd molecuul verspreidt overtollige energie via vibrationele relaxatie naar de grondtoestand, waardoor thermische verwarming van de omringende oplosmiddel 1,12. Voor oplosmiddelen zoals water, dit tot een snelle-expansie (AV Th). Aangeslagen toestand moleculen kunnen ook onder fotochemische processen die leiden tot niet-thermische volumeveranderingen (AV nonth) door bindingssplitsing / formatie en / of veranderingen …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (MCB 1.021.831, JM) en J. & E. Biomedical Research Program (Florida Department of Health, JM).
Materials
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation, |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide(III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurments |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurments |
| He-Ne Laser Diode 5mW 635nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurments |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurments |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmind Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 – 2000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlab | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
References
- Gensch, T., Viappiani, C. Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology. Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).
- Larsen, R. W., Mikšovská, J. Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins. Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).
- Westrick, J. A., Peters, K. S. A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin. Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).
- Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin. J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).
- Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL. Biochimie. 44 (30), 10028-10036 (2005).
- Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3. FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).
- Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation. Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).
- Kondoh, M., et al. Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome. J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).
- Eisenberg, H. Equation for the Refractive Index of Water. J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).
- Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen. Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).
- Miksovska, J., Larsen, R. W. Structure-function relationships in metalloproteins. Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).
- Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands. Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).
- Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).
