שינויי קונפורמציה Submillisecond בחלבונים נפתר על ידי photothermal Beam הסטה
Summary
כאן אנו מדווחים יישום של טכניקת הסטת קרן photothermal בשילוב עם תרכובת בכלוב סידן, DM-nitrophen, לעקוב אחר דינמיקת המיקרו והאלפית שנייה והאנרגטיקה של שינויים מבניים הקשורים לעמותת סידן לחיישן סידן עצבי, אלמנט רגולטורים במורד אנטגוניסט מודולטור .
Abstract
סטיה קרן photothermal יחד עם calorimetry תמונה אקוסטי ותרמי צורמת שייכת למשפחה של שיטות photothermal שלפקח בזמן פרופיל הנפח ואנתלפיה שינויי אור הנגרמים שינויי קונפורמציה בחלבונים במייקרו לאלפית שני בזמן קשקשים שאינם נגישים באמצעות מסורתית תחנה תזרים מכשירים. בנוסף, מאז שינויים הכוללים בנפח ו / או אנתלפיה הם חקרו, ניתן ליישם את הטכניקות הללו לחלבונים וBiomacromolecules האחרים שחסרים fluorophore ואו תווית chromophore. כדי לעקוב אחר דינמיקה ואנרגטיקה של שינויים מבניים הקשורים Ca 2 + מחייב מתמרים סידן, סידן חיישנים עצביים כגון, תרכובת סידן בכלוב, DM-nitrophen, הוא מועסק צילום הדק עלייה מהיר (τ <20 μsec) בסידן חופשי שינויי ריכוז והנפח הקשורים ואנתלפיה הם חקרו באמצעות טכניקת סטיה קרן photothermal.
Introduction
שיטות צילום תרמי כגון calorimetry photoacoustic, סטיה קרן photothermal (PDB), וצורם חולפים בשילוב עם עירור לייזר שבריר שנייה מייצגות חלופה רבת עוצמה ל חולפת spectroscopies האופטי ללימודים של ביניים קצרים 1,2 זמן נפתר. בניגוד לשיטות אופטיות, כגון קליטה חולפת וספקטרוסקופיה IR, העוקב אחר הפרופיל של שינויי קליטה בכרומופור שמסביב הזמן; טכניקות photothermal לזהות בזמן התלות של שינויי חום / נפח ולכן הם כלים רבי ערך לחקר פרופילים של אופטי זמן תהליכים "שקטים". עד כה, calorimetry photoacoustic והצורם חולפים כבר מיושמים בהצלחה ללמוד דינמיקה קונפורמציה של תהליכים הנגרם תמונה כוללים הגירת יגנד דו אטומית בglobins 3,4, אינטראקציות יגנד עם חלבון חיישן חמצן FixL 5, אלקטרון ופרוטון בתחבורת heme-נחושת oxidases 6nd photosystem השני, כמו גם צילום isomerization ברודופסין 7 ודינמיקת קונפורמציה בCryptochrome 8.
כדי להרחיב את היישום של טכניקות photothermal למערכות ביולוגיות שחסרות chromophore ו / או fluorophore פנימי, טכניקת PBD הייתה בשילוב עם השימוש במתחם בכלוב לצילום הדק עלייה בריכוז ליגנד / מצע בתוך כמה מיקרו או מהיר יותר, בהתאם במתחם בכלוב. גישה זו מאפשרת ניטור של דינמיקה ואנרגטיקה של שינויים מבניים הקשורים ליגנד / המצע מחייב את חלבונים שחסרים fluorophore או כרומופור פנימי ובזמן בקנה מידה שאינם נגישים על ידי עצירת זרימת מכשירים מסחריים. הנה יישום של PBD כדי לפקח על התרמודינאמיקה של מתחם הכלוב, Ca 2 + DM-nitrophen, צילום מחשוף כמו גם קינטיקה לCa 2 + עמותה לתחום בטרמינל C-של חיישן סידן העצבי דאוןזרם התקינה האלמנט אנטגוניסט מודולטור (חלום) מוצג. Ca 2 + הוא מCa-שוחררה תמונה 2 + DM-nitrophen בתוך 10 μsec וrebinds לכלוב unphotolysed עם קבוע של ~ 300 μsec זמן. מצד השני, בנוכחות apoDREAM הקינטית נוספת המתרחש בזמן בקנה המידה אלפית השנייה הוא ציין ומשקף את יגנד מחייב את החלבון. היישום של PBD לחקור מעברי קונפורמציה במערכות ביולוגיות היה מוגבל בדרך כלשהי בשל קשיי אינסטרומנטלי; יישור למשל מפרך של החללית וקרן משאבה כדי להשיג אות PBD חזקה ושחזור. עם זאת, עיצוב מוקפד של הגדרת מכשור, שליטה מדויקת של הטמפרטורה, ויישור זהיר של קרן הבדיקה ומשאבה מספקים אות PBD עקבית ויציבה, המאפשרת ניטור של זמן נפתר שינויי אנתלפיה ועוצמת קול ברחב זמן בקנה מידה מ10 μsec כ 200 לאלפיות שניים. בנוסף, modifications של ההליך ניסיוני כדי להבטיח זיהוי של עקבות מדגם והתייחסות בטמפרטורה זהה, הרכב חיץ, אורינטצית תא אופטי, כוח הלייזר, וכו 'מפחית באופן משמעותי את השגיאה הניסיונית בכמויות תגובה נמדדו וenthalpies.
Protocol
Representative Results
Discussion
העיקרון הפיזי מאחורי שיטות photothermal הוא שמולקולת צילום מתרגש מתפוגגת אנרגיה עודפת באמצעות הרפיה רטט למצב הקרקע, וכתוצאה מחימום תרמית של 1,12 ממס שמסביב. לממסים, כגון מים, זה מייצר התרחבות מהירה נפח (ΔV ה). מולקולות נרגשת מדינה עשויות גם לעבור תהליכי פוטו כי תוצ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (MCB 1,021,831, JM) וי & E. ביו רפואית תכנית המחקר (פלורידה מחלקת בריאות, JM).
Materials
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation, |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide(III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurments |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurments |
| He-Ne Laser Diode 5mW 635nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurments |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurments |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmind Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 – 2000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlab | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
References
- Gensch, T., Viappiani, C. Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology. Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).
- Larsen, R. W., Mikšovská, J. Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins. Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).
- Westrick, J. A., Peters, K. S. A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin. Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).
- Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin. J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).
- Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL. Biochimie. 44 (30), 10028-10036 (2005).
- Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3. FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).
- Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation. Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).
- Kondoh, M., et al. Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome. J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).
- Eisenberg, H. Equation for the Refractive Index of Water. J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).
- Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen. Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).
- Miksovska, J., Larsen, R. W. Structure-function relationships in metalloproteins. Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).
- Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands. Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).
- Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).
