Submillisecond alterações na conformação das proteínas resolvidas por Photothermal Boca deflexão
Summary
Aqui descrevemos uma aplicação da técnica de deflexão do feixe fototérmica em combinação com um composto de cálcio enjaulado, DM-nitrophen, para monitorar microssegundo e milissegundo dinâmica e energética de mudanças estruturais associadas com a associação de cálcio para um sensor de cálcio neuronal, Downstream Elemento Regulador Antagonista modulador .
Abstract
Deflexão do feixe Photothermal conjunto com foto-acústica calorimetria e ralar térmica pertence à família de métodos fototérmicos que monitorar o tempo de perfil de volume e entalpia mudanças de luz induzidas mudanças conformacionais em proteínas em microssegundos para milissegundo prazos que não são acessíveis através de parada tradicional -fluxo de instrumentos. Além disso, uma vez que as alterações globais de volume e / ou entalpia são sondados, estas técnicas podem ser aplicadas às proteínas e outras biomacromoléculas que carecem de um fluoróforo e um rótulo ou cromóforo. Para monitorar a dinâmica e energética de mudanças estruturais associadas ao Ca 2 + ligação a transdutores de cálcio, tais sensores de cálcio neuronais, um composto de cálcio enjaulado, DM-nitrophen, é empregado para foto-trigger um aumento rápido (τ <20 ms) em cálcio livre concentração eo volume associado e entalpia mudanças são detectados usando feixe fototérmica técnica deflexão.
Introduction
Métodos foto-térmico, como a calorimetria fotoacústica, deflexão do feixe fototérmica (APO), e ralar transitória juntamente com excitação laser de nanossegundos representam uma alternativa poderosa para transitória espectroscopia óptica para estudos resolvido em tempo de curta duração intermediários 1,2. Em contraste com as técnicas ópticas, tais como a absorção transiente e espectroscopia de infravermelho, que acompanhar o perfil do tempo de alterações de absorção do cromóforo circundante; técnicas fototérmicos detectar o tempo-dependência de alterações de calor / volume e, portanto, são ferramentas valiosas para investigar os perfis de tempo de opticamente processos de "Silêncio". Até agora, calorimetria fotoacústica e ralar transitória tem sido aplicado com sucesso para estudar a dinâmica dos processos de conformação induzida por fotografias, incluindo a migração ligante diatômico em globinas 3,4, ligante com a proteína sensor de oxigênio FixL 5, elétrons e transporte de prótons em heme-oxidases de cobre 6 umaª fotossistema II, bem como foto-isomerização em rodopsina 7 e dinâmica conformacional em cryptochrome 8.
Para expandir a aplicação de técnicas de fototérmicos aos sistemas biológicos que faltam um cromóforo e / ou fluoróforo interna, a técnica de PBD foi combinado com a utilização do composto de foto-enjaulado gatilho um aumento na concentração do ligando / substrato dentro de alguns microssegundos ou mais rápido, dependendo no composto enjaulado. Esta abordagem permite o monitoramento da dinâmica e energética de mudanças estruturais associadas com a ligação do ligante / substrato para as proteínas que estão faltando um fluoróforo interna ou cromóforo e em escala de tempo que não são acessíveis por instrumentos stop-flow comerciais. Aqui uma aplicação de PBD para monitorar a termodinâmica do composto gaiola, Ca 2 + DM-nitrophen, foto-clivagem, assim como a cinética de Ca 2 + associação para o domínio C-terminal do sensor de cálcio neuronais de Downfluxo Reguladora Elemento Antagonista modulador (sonho) é apresentado. O Ca 2 + é de Ca-lançado foto 2 + DM-nitrophen dentro de 10 ms e religa a uma gaiola unphotolysed com uma constante de tempo de ~ 300 ms. Por outro lado, na presença de um apoDREAM cinética adicional que ocorre na escala de tempo de milisegundos é observada e reflecte a ligação da proteína ligando. A aplicação do PBD para investigar transições conformacionais em sistemas biológicos tem sido de alguma forma limitada devido às dificuldades instrumentais, por exemplo árdua alinhamento da sonda e feixe de bomba para alcançar um sinal de PBD forte e reprodutível. No entanto, uma concepção meticulosa de uma instrumentação de configuração, um controle preciso da temperatura, e um alinhamento cuidadoso do feixe de sonda e uma bomba de proporcionar um sinal de PBD consistente e robusto que permite a monitorização do volume de resolução por tempo e mudanças de entalpia numa ampla escala de tempo de 10 ms para aproximadamente 200 ms. Além disso, modificções do procedimento experimental para assegurar a detecção de vestígios de amostra e de referência em temperatura idêntica, a composição do tampão, a orientação da célula óptica, a potência do laser, etc reduz significativamente o erro experimental em volumes de reacção medidos e as entalpias.
Protocol
Representative Results
Discussion
O princípio físico por trás de métodos fototérmicos é que uma molécula foto-animado dissipa o excesso de energia através de relaxamento vibracional para o estado fundamental, resultando em aquecimento térmico do 1,12 solvente circundante. Para solventes, tais como água, esta produz uma expansão rápida de volume (? V th). Moléculas em estado animado também podem passar por processos fotoquímicos que resultam em mudanças de volume nonthermal (? V nonth) devido à ligação …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (MCB 1.021.831, JM) e J. & E. Programa de Pesquisa Biomédica (Florida Department of Health, JM).
Materials
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation, |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide(III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurments |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurments |
| He-Ne Laser Diode 5mW 635nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurments |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurments |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmind Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 – 2000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlab | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
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