광열 편향 빔에 의해 해결 단백질의 밀리 초 이하의 구조적 변화
Summary
여기에서 우리는 마이크로 및 밀리 역학 및 신경원 칼슘 센서 하류 조절 요소 길항제 변조기 칼슘 연관과 관련된 구조적 변경의 지학을 모니터링 갇힌 칼슘 화합물, DM-nitrophen과 조합 광열 빔 편향 기술의 응용을보고 .
Abstract
함께 사진 음향 열량 및 열 격자와 광열 빔 편향은 기존의 정지를 사용하여 액세스 할 수없는 시간 규모를 밀리 초 단위로 마이크로에 단백질의 구조적 변화를 유도 빛의 시간 프로파일 볼륨과 엔탈피 변화를 모니터링 광열 방법의 가족에 속한다 흐름 악기. 양 및 / 또는 전체적인 엔탈피 변화가 프로빙 때문에 또한, 이들 기술은 형광 물질과 또는 발색단 라벨 부족한 단백질 및 다른 생체 고분자에 적용 할 수있다. 칼슘과 관련된 구조적인 변화의 역학과 에너지 부문을 모니터링하려면 + 칼슘 트랜스 듀서, 이러한 신경 세포의 칼슘 센서, 갇힌 칼슘 화합물, DM-nitrophen, 사진 트리거에게 무료로 칼슘의 빠른 (τ <20 마이크로 초) 증가 채용에 바인딩 농도와 연관된 부피 및 엔탈피 변화는 광열 편향 빔 기술을 이용하여 조사됩니다.
Introduction
이러한 광 음향 열량, 광열 빔 편향 (PDB) 및 나노초 레이저 여기와 결합 과도 격자로 광열 방법은 일시적인 중간체 1,2의 시간 분해 연구를위한 광학 분광기를 과도 할 수있는 강력한 대안을 나타냅니다. 이러한 과도 흡수 및 IR 분광법 등의 광학 기법과 대조적으로, 그 주위의 발색단의 흡수 변화의 시간 프로파일을 모니터링; 광열 기술은 광학적으로의 시간 프로파일을 조사 할 가치있는 도구를 히트 / 부피 변화의 시간 의존성을 감지하고, 따라서 아르 "침묵"처리합니다. 지금까지, 광 음향 열량 과도 격자가 성공적으로 글로빈 3,4, 산소 센서 단백질과 리간드의 상호 작용에 이원자 리간드의 마이그레이션을 포함하여 사진에 의한 프로세스의 구조적 역학을 연구하기 위해 적용되었습니다 FixL 5, 6 산화 효소 전자와 헴 – 구리의 양자 전송차 광계 II뿐만 아니라 로돕신 7 크립토 8 구조적 역학의 광 이성화.
내부 발색단 및 / 또는 형광 물질이 결여되어 생물학적 시스템에 광열 기술의 애플리케이션을 확장, PBD 기법 따라 광 트리거 갇힌 화합물의 용도 몇 마이크로 초 내에 리간드 / 기질 농도의 증가와 함께 또는 빠른 결합시켰다 갇힌 화합물에. 이 방법은 수있는 리간드 / 기판 내부 형광 또는 발색단 부족한 단백질 및 상업 정지 흐름 악기로 액세스 할 수없는 시간 규모에 바인딩과 관련된 구조적인 변화의 역학과 에너지 부문의 모니터링. 여기 케이지 화합물, 칼슘의 열역학 2 + DM-nitrophen, 사진 – 분열뿐만 아니라 신경 세포의 칼슘 센서의 C-말단 도메인에 칼슘 2 + 협회에 대한 반응 속도 아래로 모니터링 할 PBD의 응용 프로그램스트림 규제 요소 길항제 변조기 (DREAM)가 제공됩니다. CA는 2 +는 10 마이크로 초 이내에 사진 출시 된 CA로부터 2 + DM-nitrophen하고 ~ 300 마이크로 초의 시간 상수 unphotolysed 케이지에 다시 바인딩합니다. 한편, apoDREAM의 존재 밀리 초의 시간 단위로 발생하는 추가적인 운동은 관찰하고 단백질에 결합하는 리간드를 반영한다. 생물학적 시스템의 구조적 전환을 조사하는 PBD의 응용 프로그램은 어떻게 든 수단의 어려움으로 인해 제한되었습니다; 강력하고 재현 PBD 신호를 달성하기 위해 프로브와 펌프 빔의 예를 들어 힘든 정렬. 그러나, 계측 셋업의 세심한 디자인, 온도의 정확한 제어, 및 프로브 및 펌프 광의 조심 배향 광범위에 시분 볼륨 및 엔탈피 변화의 모니터링을 허용 일관되고 견고한 PBD 신호를 제공 10 마이크로 초 약 200 밀리 초까지 시간 규모. 또한, modific에서등 동일한 온도, 버퍼 구성, 광 셀 방향, 레이저 파워, 아래 샘플과 참조 흔적의 검출을 보장하기 위해 실험 절차의 관리 포인트는 크게 측정 반응 볼륨과 열량의 실험 오차를 줄일 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
광열 방법 뒤에 물리적 원리는 광 여기 분자 주위 용매 1,12 열적 가열의 결과, 바닥 상태로 이완 진동을 통해 과량의 에너지를 소산이다. 물과 같은 용매, 이것은 급격한 체적 팽창 (ΔV 번째)를 생성한다. 여기 상태의 분자 인해 결합 벽개 / 형성 및 / 또는 분자 (들) (반 데르 소재 즉 변화의 분자 크기를 변경할 수있는 분자 구조의 변화에 비열 부피 변화 (ΔV의 nonth) 발…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 과학 재단 (MCB 1,021,831, JM)와 J. & E. 바이오 메디컬 연구 프로그램 (건강의 플로리다학과, JM)에 의해 지원되었다.
Materials
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation, |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide(III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurments |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurments |
| He-Ne Laser Diode 5mW 635nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurments |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurments |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmind Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 – 2000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlab | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
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